Portaria 503/94
de 6 de Julho
O Decreto-Lei 128/86, de 3 de Junho, ao estabelecer regras que disciplinam o mercado de produtos cosméticos e de higiene corporal, prevê a adopção de um sistema de controlo de qualidade daqueles produtos.

A implementação de um tal sistema reveste-se de manifesta vantagem quer para os industriais, que vêem deste modo os seus produtos prestigiados, quer para os cidadãos, que vêem assim os seus direitos devidamente acautelados.

Pretende-se com este diploma estabelecer métodos de amostragem e de análise que permitam um controlo oficial dos produtos cosméticos e de higiene corporal, de forma a garantir que os princípios e as restrições impostos pelas sucessivas portarias de adaptação ao progresso técnico que neste domínio vêm sendo publicadas são respeitados.

Para além dos objectivos referidos, o presente diploma visa uma harmonização da legislação nacional com as seguintes directivas do Conselho das Comunidades Europeias:

Directiva n.º 80/1335/CEE , de 22 de Dezembro;

Directiva n.º 82/434/CEE , de 14 de Maio;

Directiva n.º 83/514/CEE , de 27 de Setembro;

Directiva n.º 85/490/CEE , de 11 de Outubro;

Directiva n.º 87/143/CEE , de 10 de Fevereiro;

Directiva n.º 90/207/CEE , de 4 de Abril.

Assim, nos termos do disposto na alínea a) do n.º 1 do artigo 10.º do Decreto-Lei 128/86, de 3 de Junho:

Manda o Governo, pelos Ministros da Indústria e Energia, da Saúde e do Comércio e Turismo, que o controlo da composição dos produtos cosméticos e de higiene corporal e respectivas matérias-primas seja efectuado de acordo com os métodos de análise constantes do anexo a este diploma e que dele faz parte integrante.

Ministérios da Indústria e Energia, da Saúde e do Comércio e Turismo.
Assinada em 17 de Março de 1994.
O Ministro da Indústria e Energia, Luís Fernando Mira Amaral. - O Ministro da Saúde, Adalberto Paulo da Fonseca Mendo. - O Ministro do Comércio e Turismo, Fernando Manuel Barbosa Faria de Oliveira.

ANEXO
Métodos de análise necessários ao controlo da composição dos produtos cosméticos

1.A PARTE
Amostragem dos produtos cosméticos
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O presente documento descreve as modalidades de amostragem dos produtos cosméticos, tendo em vista a sua análise nos diferentes laboratórios.

2 - Definições:
Amostra elementar: unidade levantada num lote destinado a venda.
Amostra global: conjunto de amostras elementares portadoras de um só número de lote.

Amostra de laboratório: parte representativa da amostra global destinada a um laboratório de análises.

Tomada de ensaio: parte representativa da amostra de laboratório necessária para uma análise.

Recipiente: objecto que pode conter um produto e que está em contacto directo e permanente com este produto.

3 - Amostragem:
3.1 - Os produtos cosméticos são retirados dos seus acondicionamentos de origem e enviados tal qual aos laboratórios.

3.2 - Para os produtos cosméticos a granel e em unidades que tiverem uma embalagem diferente da embalagem original serão estabelecidas prescrições especiais com vista à amostragem.

3.3 - As normas analíticas e o número de análises a efectuar por cada laboratório determinam o número de amostras elementares necessário para preparar a amostra de laboratório.

4 - Identificação de amostras:
4.1 - As amostras colhidas devem ser seladas no local da colheita e devidamente identificadas.

4.2 - Cada amostra elementar deve possuir as indicações seguintes:
Identificação do produto cosmético e de higiene corporal, com referência ao nome e número de lote;

Data, hora e local da colheita;
Nome da pessoa que efectua a colheita;
Nome da entidade que efectua o controlo.
4.3 - Deve ser lavrado um auto de amostragem de acordo com normas estabelecidas.

5 - Armazenagem das amostras:
5.1 - As amostras elementares devem ser armazenadas segundo as indicações do fabricante inscritas no rótulo.

5.2 - Na falta de indicações especiais, todas as amostras devem ser guardadas ao abrigo da luz e a temperatura compreendida entre 10ºC e 25ºC.

5.3 - As amostras elementares só deverão ser abertas no início da análise.
2.A PARTE
Tratamento das amostras de laboratório
1 - Generalidades:
1.1 - A determinação analítica é efectuada em cada uma das amostras elementares ou, se a quantidade for insuficiente, num número mínimo de amostras elementares previamente homogeneizadas.

1.2 - Abrir o recipiente, sob gás inerte, se o método de análise o especificar, e tirar o número necessário de tomadas de ensaio o mais rapidamente possível. A análise deverá ser efectuada no mais curto prazo de tempo. Se a amostra tiver de ser conservada, tornar a fechar cuidadosamente o recipiente sob gás inerte.

1.3 - Os produtos cosméticos podem apresentar-se em três estados: líquido, pastoso e sólido.

Se os produtos cosméticos, em embalagem de origem, apresentarem separação de fases, devem ser previamente homogeneizados.

1.4 - Se um produto cosmético é acondicionado sob uma forma que torne impossível o seu tratamento em conformidade com as presentes directrizes e que não está prevista nos métodos de análise, pode adoptar-se uma técnica específica, que deverá ser descrita pormenorizadamente no relatório final.

2 - Estado líquido:
2.1 - Neste estado encontram-se, nomeadamente, produtos como água de toilette, loção, solução, óleo e leite, os quais podem ser acondicionados em frasco, garrafa, ampola ou bisnaga.

2.2 - Tomada de ensaio:
Agitar vigorosamente o recipiente antes de abrir;
Abrir de acordo com as condições especificadas;
Deitar alguns mililitros do líquido num tubo de ensaio, a fim de examinar visualmente as suas características com vista à colheita;

Fechar o recipiente; ou
Efectuar as tomadas de ensaio necessárias à análise e fechar de novo o recipiente.

3 - Estado pastoso:
3.1 - Neste estado encontram-se, nomeadamente, produtos tais como creme, emulsão e gele, os quais podem ser acondicionados em bisnaga, frasco flexível ou boião.

3.2 - Tomada de ensaio:
Dois casos são possíveis:
3.2.1 - Recipiente com abertura estreita (bisnaga, frasco flexível). - Eliminar pelo menos o primeiro centímetro do produto a analisar. Efectuar a tomada de ensaio e fechar o recipiente imediatamente.

3.2.2 - Recipiente com abertura larga (boião). - Raspar ligeiramente a superfície, a fim de eliminar a camada superficial. Efectuar a tomada de ensaio e fechar imediatamente o recipiente.

4 - Estado sólido:
4.1 - Neste estado encontram-se, nomeadamente, produtos tais como pó, pó compacto, bâton e bloco, que podem ser acondicionados em caixa ou estojo.

4.2 - Tomada de ensaio:
Dois casos são possíveis:
4.2.1 - Pó. - Antes de tirar a cápsula ou tampa, agitar o pó o mais vigorosamente possível. Destapar e efectuar a tomada de ensaio.

4.2.2 - Pó compacto, bâton ou bloco. - Eliminar, por leve raspagem, a camada superficial do sólido e efectuar a tomada de ensaio.

5 - Produtos acondicionados sob pressão de gás:
5.1 - Estes produtos são definidos no artigo 1.º do Decreto-Lei 108/92, de 2 de Junho.

5.2 - Tomada de ensaio:
Após agitação vigorosa, uma parte representativa do conteúdo do recipiente é transvasada com a ajuda de um dispositivo de recolha para um frasco de vidro plastificado transparente provido de uma válvula. Este frasco não tem tubo mergulhador. Em casos particulares, o método de análise poderá prever outros dispositivos de recolha.

Quatro situações se podem apresentar:
5.2.1 - Se o conteúdo é uma solução homogénea, está pronto para análise.
5.2.2 - Se o conteúdo é constituído por duas fases líquidas, a análise de cada uma das fases pode ser efectuada após transferência da fase inferior para um segundo frasco. Esta fase é muitas vezes aquosa e já não contém gás propulsor (caso butano/água). Neste caso, aquando da transferência, o colo do frasco deve ser orientado para baixo (figura 4).

5.2.3 - Se o conteúdo é constituído por pó em suspensão, pode analisar-se a fase líquida após a separação do pó.

5.2.4 - Se o conteúdo é constituído por espuma, introduzir previamente no frasco de colheita uma quantidade conhecida, por pesagem de 2-metoxi-etanol (5 g a 10 g). Aquando da desgaseificação, o 2-metoxi-etanol impede a formação de espuma, sendo assim já possível separar os gases propulsores sem perder líquido.

5.3 - Aparelhagem:
O dispositivo de recolha (figura 1) é fabricado em duralumínio ou latão. Este dispositivo, descrito a título de exemplo, é concebido para se adaptar aos diferentes tipos de válvula, por intermédio de uma ligação em polietileno. Outros dispositivos de recolha podem ser utilizados (figuras 2 e 3).

O dispositivo de recolha é de vidro branco revestido exteriormente de uma protecção plastificada transparente. A sua capacidade é de 50 ml a 100 ml. É equipado com uma válvula e não tem tubo mergulhador (figura 4).

5.4 - Técnica:
Para transferir uma quantidade suficiente de produto, é necessário libertar o frasco de colheita do ar que contém. Para isso, e com a ajuda do dispositivo de recolha, introduzir cerca de 10 ml de diclorodifluorometano ou de butano, consoante a natureza do produto a examinar. A seguir, desgaseificar totalmente até desaparecimento da fase líquida, sendo o frasco mantido com a válvula para cima. Retirar o dispositivo de recolha e tarar o frasco de colheita (a) em gramas. Agitar vigorosamente o recipiente do qual se deve retirar a amostra. Adaptar o dispositivo de recolha à válvula do recipiente, colocado com a válvula para cima, adaptar o frasco da colheita, o colo para baixo, no dispositivo de recolha e carregar. Encher o frasco de colheita até cerca de dois terços.

Se a transferência parar prematuramente devido ao equilíbrio das pressões, é possível prosseguir arrefecendo o frasco de colheita. Retirar o dispositivo de recolha e pesar o frasco (b), em gramas, a fim de determinar a massa do produto transferido (m1) (m1 = b - a).

A amostra assim obtida pode ser utilizada:
Para a análise química habitual;
Para uma análise das substâncias voláteis por cromatografia em fase gasosa.
5.4.1 - Análise química:
Efectuar as operações seguintes, mantendo o frasco de colheita com o colo para cima:

Desgaseificar. Se a desgaseificação provocar a formação de espuma, utilizar um frasco de colheita contendo uma quantidade exactamente pesada de 2-metoxi-etanol (5 g a 10 g), introduzida por meio de uma seringa, por intermédio do dispositivo de recolha;

Terminar a eliminação quantitativa das substâncias voláteis, agitar num banho termostatado a 40ºC. Retirar o dispositivo de recolha;

Pesar (c gramas), a fim de determinar a massa do resíduo (m2), sendo m2 = c - a. Para o cálculo do peso do resíduo, ter em consideração a quantidade de 2-metoxi-etanol introduzida, se for caso disso;

Abrir o frasco, retirando-lhe a válvula;
Dissolver quantitativamente o resíduo numa quantidade conhecida de solvente apropriado;

Efectuar o doseamento considerado numa parte alíquota.
R = r x m(índice 2)/m(índice 1) e Q = R x P/100
em que:
m(índice 1) = massa de produto transferido para o frasco de recolha;
m(índice 2) = massa do resíduo após aquecimento a 40ºC;
r = percentagem da substância doseada em m(índice 2), determinada por método apropriado;

R = percentagem da substância doseada na totalidade do produto;
Q = quantidade total absoluta da substância doseada na totalidade do produto;
P = massa líquida do produto total acondicionado antes do início das operações.

5.4.2 - Análise das substâncias voláteis por cromatografia em fase gasosa:
5.4.2.1 - Princípio:
Do frasco de colheita, retirar a quantidade de líquido apropriada com a seringa de gases e injectar o conteúdo da seringa no cromatógrafo.

5.4.2.2 - Aparelhagem:
Seringa de gases (figura 5). Precision sampling series A2, ou seringa equivalente. - Esta seringa tem uma válvula corrediça na sua extremidade-agulha. A ligação da seringa ao frasco de colheita é efectuada por meio de um adaptador do lado do frasco e de um tubo em polietileno do lado da seringa com 8 mm de comprimento e 2,5 mm de diâmetro.

5.4.2.3 - Técnica:
Após ter transferido uma quantidade apropriada do produto para o frasco de colheita, por meio do dispositivo de recolha, adaptar a seringa ao frasco de colheita, tal como indicado no n.º 5.4.2.2. Com a válvula na posição aberta, aspirar uma quantidade apropriada de líquido. Eliminar as bolhas gasosas por vaivém sucessivo do pistão, arrefecendo a seringa, se necessário. Logo que o líquido contido na seringa não apresentar bolhas, fechar a válvula e puxar a seringa para fora do frasco de colheita. Adaptar uma agulha e, após introdução no injector do cromatógrafo, abrir a válvula e injectar.

5.4.2.4 - Padrão interno:
Se for necessário, utilizar um padrão interno. Este pode ser introduzido no frasco de colheita por meio de uma seringa, por intermédio do dispositivo de recolha.

(ver documento original)
3.A PARTE
Ensaios
CAPÍTULO I
Ácido fenolsulfónico - Identificação e doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve a identificação e o doseamento do ácido fenolsulfónico nos produtos cosméticos, tais como aerossóis e loções faciais.

2 - Definição:
O teor da amostra em ácido fenolsulfónico determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa de fenolsulfonato de zinco anidro.

3 - Princípio:
A amostra destinada ao exame é concentrada, sob pressão reduzida, dissolvida em água e purificada por extracção com clorofórmio. O doseamento do ácido fenolsulfónico é efectuado por bromoiodometria numa alíquota da solução aquosa filtrada.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Ácido clorídrico concentrado a 36% (d(elevado 20)(índice 4) = 1,18).
4.2 - Clorofórmio.
4.3 - 1-butanol.
4.4 - Ácido acético glacial.
4.5 - Iodeto de potássio.
4.6 - Brometo de potássio.
4.7 - Carbonato de sódio.
4.8 - Ácido sulfanílico.
4.9 - Nitrito de sódio.
4.10 - Solução de bromato de potássio 0,1 N.
4.11 - Solução de tiossulfato de sódio 0,1 N.
4.12 - Solução aquosa de amido a 1% (m/v).
4.13 - Solução aquosa de carbonato de sódio a 2% (m/v).
4.14 - Solução aquosa de nitrito de sódio a 4,5% (m/v).
4.15 - Solução de ditizona a 0,05% (m/v) em clorofórmio.
4.16 - Eluente: 1-butanol, ácido acético glacial, água (4:1:5, em volume). Após mistura numa ampola de decantação, elimina-se a fase inferior.

4.17 - Reagente de Pauly:
Dissolver, aquecendo, 4,5 g de ácido sulfanílico (4.8) em 45 ml de ácido clorídrico concentrado (4.1) e diluir com água até 500 ml. Deixar arrefecer 10 ml da solução num recipiente com água gelada e acrescentar 10 ml, agitando, de uma solução fria de nitrito de sódio (4.14). Deixar repousar esta mistura durante quinze minutos a 0ºC (a esta temperatura, a solução é estável durante um a três dias) e acrescentar 20 ml de solução de carbonato de sódio (4.13) antes de pulverização.

4.18 - Placas de celulose já preparadas para a cromatografia em camada fina, formato 20 cm x 20 cm; espessura da camada absorvente: 0,25 mm.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Balões de fundo redondo de 100 ml.
5.2 - Ampola de decantação de 100 ml.
5.3 - Matrases de 250 ml.
5.4 - Bureta de 25 ml.
5.5 - Pipetas com capacidades de 1 ml, 2 ml e 10 ml.
5.6 - Pipeta graduada de 5 ml.
5.7 - Seringa para injecção de 10 (mi)l, graduada a um décimo de microlitro.
5.8 - Termómetro graduado de 0ºC a 100ºC.
5.9 - Banho-maria, termostatado.
5.10 - Estufa bem ventilada e regulada a 80ºC.
5.11 - Acessórios usuais para a cromatografia em camada fina.
6 - Preparação da amostra:
Para identificação e doseamento do ácido fenolsulfónico nos aerossóis como são descritos abaixo, utiliza-se o resíduo obtido, depois de libertar o conteúdo do aerossol dos solventes e propulsores que são voláteis sob uma pressão normal.

7 - Identificação:
7.1 - Em seis pontos da linha de partida situada a 1 cm da parte de baixo da placa de celulose (4.18) pôr sucessivamente, por meio de uma seringa para injecção (5.7), 5 (mi)l do resíduo (6) ou da amostra.

7.2 - Colocar a placa numa tina contendo já o solvente de desenvolvimento (4.16) e esperar que a frente do solvente tenha atingido uma linha situada a 15 cm da linha de partida.

7.3 - Retirar a placa da tina e secar a 80ºC até à evaporação total do ácido acético. Pulverizar a placa com solução de carbonato de sódio (4.13) e deixar secar ao ar.

7.4 - Cobrir metade da placa com uma placa de vidro e pulverizar com a solução de ditizona a 0,05% (4.15) sobre a metade não coberta. Em presença de iões zinco, manchas vermelhas-lilás aparecem no cromatograma.

7.5 - Cobrir de seguida com uma placa de vidro a metade da placa que recebeu a pulverização de ditizona e pulverizar com o reagente de Pauly (4.17) sobre a outra metade; em presença de ácido fenolsulfónico, aparecem no cromatograma uma mancha castanha-amarelada (ácido p-fenolsulfónico) com um valor de Rf vizinho de 0,26 e uma mancha amarela (ácido m-fenolsulfónico) com um valor de Rf vizinho de 0,45.

8 - Doseamento:
8.1 - Pesar 10 g de amostra ou de resíduo (6) num balão com fundo redondo de 100 ml e concentrar a vácuo por meio de evaporador rotativo em banho-maria a 40ºC.

8.2 - Com uma pipeta, deitar 10 ml de água (V1) num balão e dissolver o resíduo de evaporação (8.1) a quente.

8.3 - Transferir quantitativamente a solução para uma ampola de decantação (5.2) e extrair por duas vezes com 20 ml de clorofórmio (4.2). Após cada extracção, rejeitar a fase clorofórmica.

8.4 - Filtrar a solução aquosa através de um filtro de pregas. Em função do teor previsto em ácido fenolsulfónico, pipetar 1 ml ou 2 ml (V2) do filtrado para um matrás de 250 ml (5.3) e diluir com água até obtenção de 75 ml da solução.

8.5 - Juntar 2,5 ml de ácido clorídrico a 36% (4.1) e 2,5 g de brometo de potássio (4.6), misturar e aquecer a solução a 50ºC em banho-maria.

8.6 - Por meio de uma bureta, juntar a quantidade de solução de bromato de potássio 0,1 N (4.10) necessária para a coloração da solução passar a amarelo, mantendo a temperatura a 50ºC.

8.7 - Juntar 3 ml de solução de bromato de potássio (4.10), fechar e colocar dez minutos em banho-maria a 50ºC. Se, passados estes dez minutos, a coloração desapareceu, acrescentar ainda 2 ml de solução de bromato de potássio (4.10) e colocar de novo o frasco rolhado durante dez minutos suplementares em banho-maria a 50ºC. Anotar a quantidade total de solução de bromato de potássio acrescentada (a).

8.8 - Arrefecer a solução à temperatura ambiente, juntar 2 g de iodeto de potássio (4.5) e misturar.

8.9 - Por meio de uma solução de tiossulfato de sódio 0,1 N (4.11), titular o iodo libertado. No fim da titulação, juntar algumas gotas de solução de amido (4.12) como indicador. Anotar a quantidade de tiossulfato de sódio utilizada (b).

9 - Cálculo:
Calcular o teor em fenolsulfonato de zinco da amostra ou do resíduo (6) em percentagem de massa (m/m) por meio da fórmula:

Percentagem (m/m) de fenolsulfonato de zinco = ((a - b) x V(índice 1) x 0,00514 x 100)/(m x V (índice 2))

na qual:
a = quantidade total, em mililitros, de solução de bromato de potássio 0,1 N acrescentada (8.7);

b = quantidade, em mililitros, de solução de tiossulfato de sódio 0,1 N utilizada aquando da titulação (8.9);

m = quantidade de amostra ou de resíduos examinados (8.1) (em miligramas);
V(índice 1) = volume, em mililitros, da solução obtida no n.º 8.2;
V(índice 2) = volume, em mililitros, do resíduo de evaporação dissolvido utilizado para exame (8.4).

Nota: No caso dos aerossóis, o resultado das determinações em percentagem (m/m) o resíduo (6) deve ser convertido em percentagem do produto de origem.

10 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor de cerca de 5% de fenolsulfonato de zinco, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,5%.

11 - Interpretação dos resultados:
Nos termos das disposições legais relativas aos produtos cosméticos, as loções faciais e os desodorizantes podem conter, no máximo, 6% (m/m) de fenolsulfonato de zinco. Por esta razão, é necessário determinar não só o teor em ácido fenolsulfónico, mas também o teor em zinco. Se se multiplicar pelo coeficiente 0,1588 o teor em fenolsulfonato de zinco calculado no n.º 9, obtém-se o teor mínimo em zinco do produto, em percentagem (m/m), tal como resulta do teor obtido em ácido fenolsulfónico. O teor efectivo em zinco determinado por processos gravimétricos e reportado às disposições específicas é, todavia, suceptível de ser mais elevado, pois os produtos cosméticos podem igualmente conter cloreto e sulfato de zinco.

CAPÍTULO II
Ácido oxálico e seus sais alcalinos nos produtos capilares - Doseamento e identificação

1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método abaixo indicado é adaptado ao doseamento e à identificação do ácido oxálico e dos seus sais alcalinos nos produtos capilares. Pode ser utilizado nas soluções e loções incolores aquosas ou hidroalcoólicas que contêm cerca de 5% de ácido oxálico ou uma proporção equivalente de oxalato alcalino.

2 - Definição:
O teor da amostra em ácido oxálico e ou em sais alcalinos deste ácido, determinado segundo este método, é expresso em percentagem de massa (m/m) de ácido oxálico.

3 - Princípio:
Após ter eliminado os produtos tensoactivos aniónicos eventuais com a ajuda de cloridrato de p-toluidina, precipita-se o ácido oxálico e ou os oxalatos sob a forma de oxalato de cálcio e filtra-se a solução. O precipitado é de seguida dissolvido em ácido sulfúrico e titulado com permanganato de potássio.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Solução de acetato de amónio a 5% (m/m).
4.2 - Solução de cloreto de cálcio a 10% (m/m).
4.3 - Etanol a 95% (v/v).
4.4 - Tetracloreto de carbono.
4.5 - Éter.
4.6 - Solução de cloridrato de p-toluidina a 6,8% (m/m).
4.7 - Solução de permanganato de potássio 0,1 N.
4.8 - Ácido sulfúrico a 20% (m/m).
4.9 - Ácido clorídrico a 10% (m/m).
4.10 - Acetato de sódio 3 H(índice 2)O.
4.11 - Ácido acético glacial.
4.12 - Ácido sulfúrico (1:1).
4.13 - Solução saturada de hidróxido de bário.
5 - Aparelhagem:
5.1 - Ampolas de decantação de 500 ml.
5.2 - Copos de vidro de 50 ml e 600 ml.
5.3 - Cadinhos filtrantes de vidro G-4.
5.4 - Provetas graduadas de 25 ml e 100 ml.
5.5 - Pipetas de 10 ml.
5.6 - Frascos para filtração sob vácuo de 500 ml.
5.7 - Trompa de água.
5.8 - Termómetro graduado de 0ºC a 100ºC.
5.9 - Agitador magnético com aquecimento.
5.10 - Magnetos revestidos de teflon.
5.11 - Bureta de 25 ml.
5.12 - Matrases de 250 ml.
6 - Técnica:
6.1 - Pesar 6 g a 7 g da amostra num copo de vidro de 50 ml; levar o pH a 3, com a ajuda de ácido clorídrico diluído (4.9). Transferir a solução, com ajuda de 100 ml de água destilada, para uma ampola de decantação. Juntar, de seguida, 25 ml de etanol (4.3), 25 ml de solução de cloridrato de p-toluidina (4.6) e 25 ml a 30 ml de tetracloreto de carbono (4.4) e agitar vigorosamente a mistura.

6.2 - Após separação das fases, rejeitar a camada inferior (fase orgânica); repetir a extracção com a ajuda dos reagentes utilizados no n.º 6.1 e rejeitar de novo a fase orgânica.

6.3 - Transferir a solução aquosa para um copo de vidro de 600 ml e eliminar o tetracloreto de carbono residual, levando a solução à ebulição.

6.4 - Juntar 50 ml de solução de acetato de amónio (4.1), levar a solução à ebulição (5.9) e juntar 10 ml de solução quente de cloreto de cálcio (4.2) à solução fervente, continuando a agitar, a fim de formar o precipitado.

6.5 - Verificar se a precipitação é completa, juntando algumas gotas de solução de cloreto de cálcio (4.2). Deixar arrefecer à temperatura ambiente. Juntar, agitando (5.10), 200 ml de etanol (4.3) e deixar repousar durante trinta minutos.

6.6 - Filtrar o líquido por cadinho filtrante de vidro (5.3). Transferir o precipitado para o cadinho filtrante com uma pequena quantidade de água quente (50ºC a 60ºC) e lavar o precipitado com água fria.

6.7 - Lavar o precipitado cinco vezes seguidas com um pouco de etanol (4.3) e de éter (4.5). Dissolver o precipitado em 50 ml de ácido sulfúrico quente (4.8), aspirando este último através do cadinho filtrante.

6.8 - Transferir quantitativamente a solução para um matrás (5.12) e titular com a ajuda de uma solução de permanganato de potássio (4.7) até à obtenção de uma fraca coloração rósea.

7 - Cálculo:
O teor da amostra expresso em ácido oxálico, em percentagem de massa (m/m), é calculado pela fórmula:

Percentagem (m/m) de ácido oxálico = A x 4,50179 x 100/E x 1000
na qual:
A = volume (em mililitros) de percentagem de potássio 0,1 N gastos no n.º 6.8;
E = quantidade da amostra utilizada no n.º 6.1, em gramas (8.9);
4,50179 = coeficiente de conversão para o ácido oxálico.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em ácido oxálico da ordem dos 5% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,15%.

9 - Identificação:
9.1 - Princípio:
O ácido oxálico e ou os oxalatos são precipitados sob a forma de oxalato de cálcio e dissolvidos em ácido sulfúrico. Junta-se de seguida um pouco de solução de permanganato de potássio; este descora e foma-se dióxido de carbono. O dióxido de carbono formado em contacto com uma solução de barita provoca a formação de um precipitado branco opaco de carbonato de bário.

9.2 - Técnica:
9.2.1 - Submeter uma parte da amostra a examinar ao tratamento indicado nos n.os 6.1 a 6.3, a fim de eliminar os produtos tensoactivos que possa conter.

9.2.2 - A cerca de 10 ml da solução obtida no n.º 9.2.1 juntar um pouco de acetado de sódio (4.10) na ponta da espátula e acidificar a solução com algumas gotas de ácido acético glacial (4.11).

9.2.3 - Juntar à solução de cloreto de cálcio a 10% (4.2) e filtrar a solução obtida. Dissolver o precipitado de oxalato de cálcio em 2 ml de ácido sulfúrico (1:1) (4.12).

9.2.4 - Transferir a solução para um tubo de ensaio e acrescentar gota a gota cerca de 0,5 ml de solução de permanganato de potássio 0,1 N (4.7). Na presença de oxalato, a solução descora, primeiro lentamente, depois rapidamente.

9.2.5 - Logo após a adição do permanganato de potássio, colocar em cima do tubo de ensaio um pequeno tubo de vidro de dimensão adequada e provido de uma rolha; aquecer ligeiramente o conteúdo e recolher o anidrido carbónico formado numa solução saturada de hidróxido de bário (4.1.3). A formação de uma nuvem leitosa de carbonato de bário, passados três a quatro minutos, indica a presença de ácido oxálico.

CAPÍTULO III
Ácido tioglicólico nos produtos para a frisagem ou a desfrisagem dos cabelos e nos depilatórios - Identificação e doseamento.

1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve a identificação e o doseamento do ácido tioglicólico nos produtos para a frisagem ou desfrisagem dos cabelos e nos depilatórios, em presença de outros redutores eventuais.

2 - Definição:
O teor da amostra em ácido tioglicólico, determinado segundo este método, é expresso em percentagem de ácido tioglicólico (m/m).

3 - Princípio:
O ácido tioglicólico é identificado quer por reacção corada, quer por cromatografia em camada fina. O seu doseamento é efectuado quer por iodometria, quer por cromatografia em fase gasosa.

4 - Identificação:
4.1 - Identificação por via química.
4.1.1 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1.1.1 - Papel de acetado de chumbo (II).
4.1.1.2 - Solução de ácido clorídrico 1:1.
4.1.2 - Técnica:
4.1.2.1 - Identificação do ácido tioglicólico por reacção corada com acetato de chumbo (II). Aplicar uma gota da amostra a analisar sobre papel de acetato de chumbo (II) (4.1.1.1). Se se obtiver uma coloração amarela-intensa, é provável a presença de ácido tioglicólico.

Sensibilidade: 0,5%
4.1.2.2 - Caracterização dos sulfuretos por formação de H(índice 2)S após reacção em meio ácido:

Num tubo de ensaio introduzir alguns miligramas da amostra a estudar. Juntar 2 ml de água destilada e 1 ml de HCl 1:1 (4.1.1.2).

Verifica-se uma libertação de H(índice 2)S, que se reconhece pelo seu cheiro e pela formação de precipitado negro de PbS sobre um papel de acetato de chumbo (II) (4.1.1.1).

Sensibilidade: 50 ppm.
4.1.2.3 - Caracterização dos sulfitos por formação de SO(índice 2) após reacção em meio ácido. Proceder como no n.º 4.1.2.2. Levar à ebulição. O SO(índice 2) reconhece-se pelo cheiro e pelas propriedades redutoras sobre o MnO(índice 4), por exemplo.

4.2 - Identificação por cromatografia em camada fina.
4.2.1 - Reagentes:
Todos os reagentes, salvo indicação em contrário, devem ser de qualidade analítica.

4.2.1.1 - Ácido tioglicólico controlado iodometricamente; pureza: >= 98% (ATG).

4.2.1.2 - Ácido ditioglicólico; pureza: >= 99% (ADTG).
4.2.1.3 - Ácido tioláctico; pureza: >= 95% (ATL).
4.2.1.4 - Ácido 3-mercaptopropiónico; pureza: >= 98% (AMP).
4.2.1.5 - 1-tioglicerol; pureza: >= 98% (TG).
4.2.1.6 - Gele de sílica GHR ou placas pré-preparadas correspondentes, de 0,25 mm de espessura, activadas a 110ºC durante trinta minutos.

4.2.1.7 - Óxido de alumínio F 254, tipo E Merck, ou equivalente, ou placas prontas para utilização, de 0,25 mm de espessura.

4.2.1.8 - Ácido clorídrico concentrado (d(elevado 20)(índice 4) = 1,19).
4.2.1.9 - Acetato de etilo.
4.2.1.10 - Clorofórmio.
4.2.1.11 - Éter di-isopropílico.
4.2.1.12 - Tetracloreto de carbono.
4.2.1.13 - Ácido acético glacial.
4.2.1.14 - Solução aquosa de iodeto de potássio a 1% (m/v).
4.2.1.15 - Solução aquosa de cloreto de platina a 0,1% (m/v).
4.2.1.16 - Eluentes:
4.2.1.16.1 - Acetato de etilo, clorofórmio, éter di-isopropílico, ácido acético glacial (20:20:10:10, em volume).

4.2.1.16.2 - Clorofórmio, ácido acético glacial (90:20, em volume).
4.2.1.17 - Reveladores:
4.2.1.17.1 - Misturar directamente antes da utilização volumes iguais da solução 4.2.1.14 e da solução 4.2.1.15.

4.2.1.17.2 - Solução de bromo a 5% (m/v):
Dissolver 5 g de bromo em 100 ml de CC1(índice 4) (4.2.1.12).
4.2.1.17.3 - Solução de fluoresceína a 0,1% (m/v):
Dissolver 100 mg de fluoresceína em 100 ml de etanol a 95%.
4.2.1.17.4 - Solução aquosa de heptamolibdato de hexa-amónio a 10% (m/v).
4.2.1.18 - Soluções padrão:
4.2.1.18.1 - Solução aquosa de ácido tioglicólico a 0,4% (m/v).
4.2.1.18.2 - Solução aquosa de ácido ditiodiglicólico a 0,4% (m/v).
4.2.1.18.3 - Solução aquosa de ácido tioláctico a 0,4% (m/v).
4.2.1.18.4 - Solução aquosa de ácido 3-mercapto propiónico a 0,4% (m/v).
4.2.1.18.5 - Solução aquosa de 1-tioglicerol a 0,4% (m/v).
4.2.2 - Aparelhagem:
Material corrente de laboratório para cromatografia em camada fina.
4.2.3 - Técnica:
4.2.3.1 - Tratamento das amostras:
Acidificar com algumas gotas de ácido clorídrico 4.2.1.8 até pH = 1 e filtrar, se for necessário. Em certos casos, pode ser necessário diluir a amostra. Neste caso, acidificá-la pelo ácido clorídrico antes de efectuar a diluição.

4.2.3.2 - Desenvolvimento:
Aplicar na placa 1 (mi)l da solução da amostra 4.2.3.1 e 1 (mi)l de cada uma das cinco soluções padrão (4.2.1.18). Secar cuidadosamente sob corrente fraca de azoto e desenvolver com os eluentes 4.2.1.16.1 ou 4.2.1.16.2. Secar o mais rapidamente possível sob azoto, de modo a evitar a oxidação dos tióis.

4.2.3.3 - Revelação:
Pulverizar a placa com o reagente 4.2.1.17.1, ou 4.2.1.17.3, ou 4.2.1.17.4. Quando a placa for pulverizada com o reagente 4.2.1.17.3, colocá-la numa tina saturada de bromo (4.2.1.17.2) até que as manchas fiquem visíveis. Quando a placa for pulverizada com o reagente 4.2.1.17.4, a revelação apenas será apropriada se o tempo de secagem da camada não ultrapassar meia hora.

4.2.3.4 - Leitura:
Comparar os valores dos Rf e a cor das soluções padrão com os da solução da amostra. Os Rf médios em camada de sílica são dados abaixo, a título indicativo, e apenas têm valor comparativo. Com efeito, dependem:

Do estado de activação da placa no momento da cromatografia;
Da temperatura da tina de cromatografia.
Quadro dos Rf obtidos em camada de sílica
(ver documento original)
5 - Doseamento (ver nota *):
Começa sempre por uma iodometria.
5.1 - Iodometria:
5.1.1 - Princípio:
O doseamento efectua-se por oxidação do grupo SH por I(índice 2) em meio ácido, segundo a equação:

(ver documento original)
5.1.2 - Reagentes:
Solução aferida de iodo 0,1 N.
5.1.3 - Aparelhagem:
Material corrente de laboratório.
5.1.4 - Técnica:
Num matrás com rolha, de 150 ml, contendo 50 ml de água destilada, pesar com exactidão de 0,500 g a 1 g de amostra. Juntar 5 ml de HCl 1:1 (4.1.1.2) (pH da solução próximo de 0) e titular pelo iodo 0,1 N (5.1.2) até ao aparecimento de uma coloração amarela. Pode utilizar-se um indicador, nomeadamente amido.

5.1.5 - Cálculo:
O teor em ácido tioglicólico é calculado segundo a fórmula:
Percentagem (m/m) de ácido tioglicólico = (92 x n x 100)/(1000 x 10 x m) = (0,92 n/m)

em que:
m = massa, em gramas, da tomada de ensino;
n = o volume de iodo 0,1 N gasto.
5.1.6 - Nota. - Se o resultado, calculado em ácido tioglicólico, for inferior em 0,1% às concentrações máximas autorizadas, não é necessário efectuar outros doseamentos. Se o resultado for igual ou superior às concentrações máximas autorizadas e se a identificação mostrou a presença de vários redutores, é então necessário efectuar o doseamento por cromatografia em fase gasosa.

5.2 - Cromatografia em fase gasosa:
5.2.1 - Princípio:
O ácido tioglicólico é separado do excipiente por precipitação sob forma de acetato de cádmio (II). Após metilação pelo diazometano preparado, quer extemporaneamente, quer previamente em solução etérea, o derivado metilado do ácido tioglicólico é doseado por cromatografia gás/líquido com caprilato de metilo como padrão interno.

5.2.2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
5.2.2.1 - Ácido tioglicólico puro, de título conhecido.
5.2.2.2 - Ácido clorídrico concentrado (ver documento original).
5.2.2.3 - Metanol.
5.2.2.4 - Solução aquosa de acetato de cádmio (II) di-hidratado a 10% (m/v).
5.2.2.5 - Solução de caprilato de metilo a 2% (m/v) em metanol.
5.2.2.6 - Solução tampão de acetato de pH 5:
Acetato de sódio, 3 H(índice 2)O: 77 g;
Ácido acético glacial: 27,5 ml;
Água desmineralizada q. b. p.: 1 l.
5.2.2.7 - Solução recentemente preparada de ácido clorídrico 3 N em metanol.
5.2.2.8 - N-metil-N-nitroso-N`-nitroguanidina.
5.2.2.9 - Solução de hidróxido de sódio 5 N.
5.2.2.10 - Solução titulada de iodo 0,1 N.
5.2.2.11 - Óxido de dietilo.
5.2.2.12 - Solução de diazometano preparada a partir de N-metil-N-nitroso p-tolueno-sulfonamida segundo Fieser (Reagents for Organic Synthesis, Ed. Wiley, 1967). A solução obtida contém cerca de 1,5 g de diazometano em 100 ml de óxido de dietilo (5.2.2.11).

Sendo o diazometano um gás tóxico e muito instável, é necessário efectuar todos os ensaios em hotte e evitar a utilização de aparelhos que tenham as juntas esmeriladas.

5.2.3 - Aparelhagem:
5.2.3.1 - Material corrente de laboratório:
5.2.3.2 - Aparelho para preparação extemporânea de diazometano (An. chem., 1973, 45,2302).

5.2.3.3 - Aparelho para preparação prévia do diazometano segundo Fieser.
5.2.4 - Preparação da amostra:
Num tubo de centrífuga de 50 ml, pesar com exactidão uma massa de amostra tal que a quantidade suposta de ácido tioglicólico seja da ordem de 50 mg a 70 mg. Acidificar com algumas gotas de HCl concentrado (5.2.2.2), até à obtenção de um pH próximo de 3.

Juntar 5 ml de água desmineralizada e 10 ml de solução tampão de acetato (5.2.2.6). Verificar, por meio de um papel indicador, se o pH está próximo de 5. De seguida juntar 5 ml de solução de acetato de cádmio (II) (5.2.2.4).

Esperar dez minutos e centrifugar pelo menos durante quinze minutos a 4000 rpm. Separar o produto sobrenadante. Pode acontecer que este contenha uma gordura insolúvel, nomeadamente no caso de um creme, e esta última não pode ser confundida com mercaptido de cádmio acumulado de modo compacto no fundo do tubo.

Verificar a ausência de precipitação aquando da adição ao líquido sobrenadante de algumas gotas de solução de acetato de cádmio (II) (5.2.2.4).

Quando as identificações precedentes tenham demonstrado a ausência de agentes redutores além dos tióis, verificar, por iodometria, se a presença de tióis no produto sobrenadante não excede 6% a 8% da quantidade inicial.

No tubo de centrífuga que contém o precipitado introduzir 10 ml de metanol (5.2.2.3), espalhar finamente o precipitado com a ajuda de uma vareta e centrifugar de novo durante, pelo menos, quinze minutos a 4000 rpm.

Decantar o produto sobrenadante e verificar por iodometria a ausência de tióis.

Uma segunda lavagem é efectuada nas mesmas condições.
Sempre no tubo de centrífuga, juntar:
2 ml de solução de caprilato de metilo (5.2.2.5);
5 ml de solução de ácido clorídrico em metanol (5.2.2.7).
Dissolver completamente o mercaptido (pode acontecer que permaneça um ligeiro resídio insolúvel devido ao excipiente). Obém-se a solução S. Sobre uma alíquota da solução S, verificar iodometricamente o teor em tióis, que deve ser pelo menos igual a 90% do que foi obtido no n.º 5.1.

5.2.5 - Metilação:
A metilação é efectuada ou extemporaneamente, segundo o processo descrito no n.º 5.2.5.1, ou com a ajuda de uma solução de diazometano, previamente preparada segundo o n.º 5.2.5.2.

5.2.5.1 - Metilação extemporânea:
No aparelho (5.2.3.2) que contém 1 ml de óxido de dietilo (5.2.2.11) introduzir 50 (mi)l da solução S. Metilar, segundo o método referenciado no n.º 5.2.3.2, com 300 mg de N-metil-N-nitroso-N'-nitroguanidina (5.2.2.8). Passados quinze minutos, verificar se a solução contém um excesso de diazometano (solução amarela) e transferir para um balão de 2 ml fechado hermeticamente. Colocar este no frigorífico durante uma noite.

Fazer simultaneamente duas metilações.
5.2.5.2 - Metilação com a solução previamente preparada de diazometano (5.2.2.12):

Num frasco com rolha de 5 ml introduzir 1 ml de diazometano (5.2.2.12) e, seguidamente, 50 (mi)l da solução S. Deixar no frigorífico durante uma noite.

5.2.6 - Preparação do padrão:
Preparar uma solução padrão de ácido tioglicólico de título conhecido, contendo cerca de 60 mg de ácido tioglicólico num volume de 2 ml. Obtém-se a solução E. Efectuar a precipitação, os doseamentos e a metilação como indicado nos n.os 5.2.4 e 5.2.5.

5.2.7 - Condições da cromatografia em fase gasosa:
5.2.7.1 - Coluna:
Natureza: ácido inoxidável;
Comprimento: 2 m;
Diâmetro: 3 mm.
5.2.7.2 - Enchimento:
Ftalato de dodecilo a 20%/Chrom. WAW 80-100 mesh.
5.2.7.3 - Detector:
Ionização de chama. É conveniente que o electrómetro seja calibrado para uma sensibilidade de 8 x 10(elevado a -10)A.

5.2.7.4 - Gás:
Gás de arrastamento: azoto.
Pressão: 2,2 b.
Débito: 35 ml/min.
Gás auxiliar: hidrogénio.
Pressão: 1,8 b.
Débito: 15 ml/min.
Detector: gás recomendado pelo fabricante.
5.2.7.5 - Temperaturas:
Injector: 200ºC;
Detector: 200ºC;
Coluna: 90ºC.
5.2.7.6 - Registador:
Velocidade: 5 mm/min.
5.2.7.7 - Quantidade injectada: 3 (mi)l.
Fazer cinco ensaios com cada amostra metilada.
5.2.7.8 - As condições da cromatografia são dadas a título indicativo, podendo ser adaptadas de modo que a resolução para o pico do ácido tioglicólico seja R >= 1,5, entendendo-se que:

R = 2 x (d'r(índice 2) - d'r(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção em minutos;
W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos picos a meia altura em milímetros;
D' = velocidade de desenrolamento do papel em milímetros/minuto.
É aconselhável terminar a cromatografia, com programação de temperatura de 90ºC a 150ºC, a 10ºC/min., a fim de eliminar as substâncias que podem interferir nos ensaios seguintes.

5.2.8 - Cálculos:
5.2.8.1 - Coeficiente de proporcionalidade do ácido tioglicólico:
É calculado em relação ao octanoato de metilo a partir da mistura padrão.
Seja:
t = o ácido tioglicólico;
k(índice t) = o seu coeficiente de proporcionalidade;
m'(índice t) = a sua massa (em miligramas) na mistura;
S'(índice t) = a área do seu pico;
C = o caprilato de metilo;
m'(índice c) = a sua massa (em miligramas) na mistura;
S'(índice c) = a área do seu pico;
K(índice t) = (m'(índice t))/(m'(índice c)) x S'(índice c)/S'(índice t)
Este coeficiente é função da aparelhagem.
5.2.8.2 - Concentração do ácido tioglicólico na amostra:
Seja:
t = o ácido tioglicólico;
k(índice t) = o seu coeficiente de proporcionalidade;
S(índice t) = a área do seu pico;
C = o caprilato de metilo;
m'(índice c) = a área do seu pico;
M = a massa (em miligramas) de tomada de ensaio inicial.
A percentagem (m/m) de ácido tioglicólico na amostra é igual a:
Percentagem (m/m) de ácido tioglicólico = (m(índice c)/M) x ((k(índice t) x S(índice t))/S(índice c)) x 100

6 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em ácido tioglicólico de 8% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos, efectuados sobre a mesma amostra, não deve ultrapassar 0,8%.

(nota *) O doseamento do ácido tioglicólico deve fazer-se sobre os produtos ainda não utilizados e destapados recentemente, de modo a evitar oxidação.

CAPÍTULO IV
Agentes de oxidação e peróxido de hidrogénio nos produtos capilares - Identificação e doseamento, respectivamente.

Objectivo e campo de aplicação:
O doseamento iodométrico do peróxido de hidrogénio nos produtos cosméticos é possível na ausência de qualquer outro agente de oxidação que reaja com iodetos para tomar o iodo. Antes de iniciar o doseamento iodométrico do peróxido de hidrogénio, é, pois, indispensável detectar e identificar outros agentes de oxidação eventualmente presentes. Esta identificação efectua-se em duas operações, a primeira dizendo respeito aos persulfatos, bromatos e peróxido de hidrogénio e a segunda ao peróxido de bário.

A - Identificação de persulfatos, bromatos e peróxido de hidrogénio
1 - Príncipio:
Os persulfatos de sódio, de potássio e de amónio, o bromato de potássio e de sódio e o peróxido de hidrogénio, quer seja ou não proveniente do peróxido de bário, são identificados por cromatografia descendente em papel, com a ajuda de dois eluentes.

2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
2.1 - Soluções aquosas de referência a 0,5% (m/v) dos compostos seguintes:
2.1.1 - Persulfato de sódio.
2.1.2 - Persulfato de potássio.
2.1.3 - Persulfato de amónio.
2.1.4 - Bromato de potássio.
2.1.5 - Bromato de sódio.
2.1.6 - Peróxido de hidrogénio.
2.2 - Eluente A: etanol a 80% (v/v).
2.3 - Eluente B: benzeno, metanol, álcool isoamílico, água (34:38:18:10, em volume).

2.4 - Reagente A: solução aquosa de iodeto de potássio a 10% (m/v).
2.5 - Reagente B: solução aquosa de amido a 1% (m/v).
2.6 - Reagente C: ácido clorídrico a 10% (m/m).
2.7 - Ácido clorídrico 4 N.
3 - Aparelhagem:
3.1 - Papel para cromatografia (Whatman n.os 3 e 4, ou equivalente).
3.2 - Micropipeta de 1 (mi)l.
3.3 - Balões aferidos de 100 ml.
3.4 - Filtros de pregas.
3.5 - Material corrente para cromatografia descendente em papel.
4 - Preparação da amostra:
4.1 - Produtos solúveis na água:
Preparar duas soluções de amostra, dissolvendo, respectivamente, 1 g e 5 g do produto em 100 ml de água. Para efectuar a cromatografia sobre papel descrita no n.º 5, utilizar 1 (mi)l de cada uma destas duas soluções.

4.2 - Produtos parcialmente solúveis na água:
4.2.1 - Pesar 1 g a 5 g de amostra, suspender em 50 ml de água, completar a 100 ml e misturar. Filtrar as duas suspensões por um filtro de pregas (3.4) e utilizar 1 (mi)l de cada um dos dois filtrados para efectuar a cromatografia em papel descrita no n.º 5.

4.2.2 - Preparar duas novas suspensões de 1 g a 5 g de amostra em 50 ml de água, acidificar com ácido clorídrico diluído (2.7), completar a 100 ml com água e misturar. Filtrar as suspensões por um filtro de pregas (3.4) e utilizar 1 (mi)l de cada um dos dois filtrados para efectuar a cromatografia em papel descrita no n.º 5.

4.3 - Cremes:
Homogeneizar separadamente 5 g e 20 g do produto com 100 ml de água e utilizar as dispersões para efectuar a cromatografia em papel descrita no n.º 5.

5 - Técnica:
5.1 - Em duas tinas para cromatografia descendente em papel, colocar uma certa quantidade de eluentes A (2.2) e B (2.3). Saturar as tinas com vapores dos eluentes durante vinte e quatro horas, pelo menos.

5.2 - Numa tira de papel para cromatografia (Whatman n.º 3, ou equivalente) de 40 cm de comprimento e 20 cm de largura (3.1), ou de outro formato adequado, colocar em cada ponto de partida 1 (mi)l de uma das soluções ou suspensões filtradas de amostra e de produto de referência preparadas de acordo com os n.os 4 e 2.1 e evaporar o solvente ao ar.

5.3 - Colocar a tira (5.2) na tina cheia de eluente A (5.1) e cromatografar até que este tenha percorrido 35 cm (cerca de quinze horas).

5.4 - Repetir as operações descritas nos n.os 5.2 e 5.3 com papel para cromatografia (Whatman n.º 4, ou equivalente) (3.1) e o eluente B (2.3). Cromatografar até que este tenha percorrido 35 cm (cerca de cinco horas).

5.5 - Após desenvolvimento, tirar as tiras de papel das tinas e secá-las ao ar.

5.6 - Revelar as manchas pulverizando:
5.6.1 - O reagente A (2.4) e logo a seguir o reagente B (2.5). As manchas de persulfatos aparecem em primeiro lugar no cromatograma, seguidas de manchas de peróxido de hidrogénio. Marcar estas manchas com um lápis.

5.6.2 - O reagente C (2.6) sobre cromatogramas obtidos no n.º 5.6.1. Aparecem manchas cinzentas-azuladas, que indicam a presença de bromatos.

5.7 - Nas condições indicadas para os eluentes A (2.2) e B (2.3), os valores Rf das soluções de referência (2.1) são os seguintes:

(ver documento original)
B - Identificação do peróxido de bário
1 - Princípio:
A presença de peróxido de bário é posta em evidência:
Por um lado, pela formação de peróxido de hidrogénio após acidificação da amostra (título A, n.º 4.2);

Por outro, pela identificação dos iões bário.
Na ausência de persulfatos (título A), junta-se ácido sulfúrico diluído a uma parte da solução amostra ácida (4.1), o que desencadeia a formação de precipitado branco do sulfato de bário. A presença de iões bário na solução amostra (4.1) é confirmada por cromatografia em papel como se indica no n.º 5. No caso de presença simultânea de persulfato e de peróxido de bário (título B, n.º 4.2) depois da fusão alcalina do insolúvel e dissolução em ácido clorídrico, detecta-se a presença do ião bário por cromatografia e ou por precipitação sob a forma de sulfato.

2 - Reagentes:
2.1 - Metanol.
2.2 - Ácido clorídrico concentrado a 36% (m/m).
2.3 - Ácido clorídrico 6 N.
2.4 - Ácido sulfúrico 4 N.
2.5 - Rodizonato dissódico.
2.6 - Cloreto de bário (Ba Cl(índice 2), 2H(índice 2)O).
2.7 - Carbonato de sódio anidro.
2.8 - Solução aquosa de cloreto de bário a 1% (m/v).
2.9 - Eluente: metanol, ácido clorídrico concentrado a 36%, água (80:10:10, em volume).

2.10 - Reagente, solução aquosa de rodizonato dissódico a 0,1% (m/v); preparar a solução imediatamente antes da utilização.

3 - Aparelhagem:
3.1 - Micropipeta de 5 (mi)l.
3.2 - Cadinhos de platina.
3.3 - Balões aferidos de 100 ml.
3.4 - Papel para cromatografia (Schleicher et Schull 2043 b, ou equivalente). Colocar durante uma noite na tina para cromatografia (título A, n.º 3.5) contendo o eluente (título B, n.º 2.9) e secar.

3.5 - Filtros de pregas.
3.6 - Material corrente para a cromatografia ascendente em papel.
4 - Preparação da amostra:
4.1 - Produtos que não contenham persulfatos:
4.1.1 - Homogeneizar ou dissolver 2 g do produto em 50 ml de água e, por meio de ácido clorídrico (2.3), levar o pH da solução a 1, aproximadamente.

4.1.2 - Transferir a solução ou suspensão para balão aferido de 100 ml. Completar o volume com água e misturar. Utilizar esta solução para efectuar a cromatografia em papel descrita no n.º 5 e para identificar o bário por precipitação do sulfato.

4.2 - Produtos que contenham persulfatos:
4.2.1 - Homogeneizar ou dissolver 2 g do produto em 100 ml de água e filtrar.
4.2.2 - Adicionar ao resíduo seco 7 a 10 vezes o seu peso de carbonato de sódio (título B, n.º 2.7), misturar e fundir a mistura num cadinho de platina (título B, 3.2) durante cerca de meia hora.

4.2.3 - Arrefecer à temperatura ambiente, colocar o produto da fusão em suspensão em 50 ml de água e filtrar (título B, n.º 3.5).

4.2.4 - Dissolver no ácido clorídrico 6 N (título B, n.º 2.3) e completar a 100 ml com água. Utilizar esta solução para efectuar a cromatografia em papel descrita no n.º 5 e para identificar o bário por precipitação do sulfato.

5 - Técnica:
5.1 - Numa tina para cromatografia ascendente em papel colocar uma certa quantidade de eluente (2.9) e saturar a tina durante quinze horas, pelo menos.

5.2 - Numa folha de papel para cromatografia, anteriormente tratada como indicado (3.4), aplicar, respectivamente, em três pontos, 5 (mi)l de cada uma das soluções preparadas (4.1.2 e 4.2.4) e da solução de referência (2.8).

5.3 - Evaporar o solvente ao ar e cromatografar na vertical até que o eluente tenha percorrido 30 cm.

5.4 - Tirar o papel da tina e secá-lo ao ar.
5.5 - Revelar as manchas no cromatograma pulverizando com reagente (2.10).
Em presença do bário, aparecem manchas vermelhas com Rf 0,10, aproximadamente.
C - Doseamento do peróxido de hidrogénio
1 - Princípio:
O doseamento iodométrico do peróxido de hidrogénio baseia-se na reacção seguinte:

(ver documento original)
Trata-se de uma reacção lenta, mas é possível acelerá-la, adicionando molibdato de amónio. O iodo formado, doseado por processos titrimétricos com uma solução de tiossulfato de sódio, permite calcular o teor em peróxido de hidrogénio.

2 - Definição:
O teor da amostra em peróxido de hidrogénio determinado segundo este método é expresso em percentagem do produto (m/m).

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Ácido sulfúrico 2 N.
3.2 - Iodeto de potássio.
3.3 - Molibdato de amónio.
3.4 - Solução de tiossulfato de sódio 0,1 N.
3.5 - Solução de iodeto de potássio a 10% (m/v). Preparar a solução extemporaneamente.

3.6 - Solução de molibdato de amónio a 20% (m/v).
3.7 - Solução de amido a 1% (m/v).
4 - Aparelhagem:
4.1 - Copos de vidro de 100 ml.
4.2 - Bureta de 50 ml.
4.3 - Balão aferido de 250 ml.
4.4 - Provetas graduadas de 25 ml e 100 ml.
4.5 - Pipetas aferidas de 10 ml.
4.6 - Matrases de 250 ml.
5 - Técnica:
5.1 - Num copo de 100 ml pesar uma quantidade (em gramas) do produto equivalente a 0,6 g, aproximadamente, de peróxido de hidrogénio; transferir quantitativamente para um balão aferido de 250 ml com a ajuda de uma pequena quantidade de água, completar o volume com água e misturar.

5.2 - Pipetar 10 ml da solução da amostra (5.1) para um balão de 250 ml (4.6) e adicionar sucessivamente 100 ml de ácido sulfúrico 2 N (3.1), 20 ml de solução de iodeto de potássio (3.5) e três gotas de solução de molibdato de amónio (3.6).

5.3 - Titular imediatamente o iodo formado com a solução de tiossulfato de sódio 0,1 N (3.4) e, na proximidade do ponto de equivalência, juntar alguns mililitros de solução de amido como indicador. Anotar a quantidade, em mililitros, de tiossulfato de sódio 0,1 N utilizada (V).

5.4 - Conforme o processo indicado nos n.os 5.1 e 5.3, efectuar um ensaio em branco, substituindo os 10 ml da solução da amostra por 10 ml de água. Anotar a quantidade em mililitros de tiossulfato de sódio 0,1 N utilizada (V(índice o)).

6 - Cálculo:
Calcular o teor do produto em peróxido de hidrogénio, em percentagem de massa (m/m), pela fórmula:

Percentagem de peróxido de hidrogénio = ((V - V(índice 0)) x 1,7008 x 250 x 100)/(m x 10 x 1000)

Percentagem de peróxido de hidrogénio = ((V - V(índice 0)) x 4,252)/m
em que:
m = a quantidade, em gramas, de produto examinado (5.1);
V(índice 0) = a quantidade, em mililitros, de solução de tiossulfato 0,1 N consumida no doseamento do ensaio em branco (5.4);

V = a quantidade, em mililitros, de solução de tiossulfato 0,1 N consumida no doseamento da solução de amostra (5.3).

7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor de peróxido de hidrogénio da ordem dos 6% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,2%.

CAPÍTULO V
Amoníaco - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve o doseamento do amoníaco livre no conjunto dos produtos cosméticos.

2 - Definição:
O teor da amostra em amoníaco determinado segundo este método é expresso em percentagem de NH(índice 3) (m/m).

3 - Princípio:
Uma solução de cloreto de bário é adicionada ao produto cosmético em meio metanol-água. O precipitado eventualmente formado é filtrado ou centrifugado. Este modo de proceder evita, no decurso da destilação em corrente de vapor, o arrastamento de certos sais de amónio, tais como o carbonato, o hidrogenocarbonato, os sais de ácidos gordos, etc., com excepção do acetato de amónio. O amoníaco é arrastado pelo vapor a partir do filtrado ou da parte sobrenadante e doseado por titrimetria de retorno com indicador, ou titrimetria potenciométrica directa.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Metanol.
4.2 - Solução de cloreto de bário di-hidratado a 25% (m/v).
4.3 - Solução de ácido ortobórico a 4% (m/v).
4.4 - Solução aferida de ácido sulfúrico 0,5 N.
4.5 - Antiespuma líquido.
4.6 - Solução aferida de hidróxido de sódio 0,5 N.
4.7 - Indicador: misturar 5 ml de uma solução de vermelho de metilo a 0,1% em etanol e 2 ml de uma solução de azul de metileno a 0,1% em água.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Centrífuga com tubos fechados.
5.3 - Aparelho de arrastamento pelo vapor.
5.4 - Potenciómetro.
5.5 - Eléctrodo de vidro e eléctrodo de referência de dicloreto de dimercúrio (calomelanos).

6 - Técnica:
6.1 - Num balão aferido de 100 ml pesar, com aproximação de 1 mg, uma quantidade da amostra (m), correspondente, no máximo, a 150 mg de NH(índice 3).

6.2 - Adicionar:
Água: 10 ml;
Metanol (4.1): 10 ml;
Solução de cloreto de bário (4.2): 10 ml.
Completar o volume com metanol (4.1).
6.3 - Homogeneizar e deixar uma noite no frigorífico (5ºC).
6.4 - A solução, ainda fria, é filtrada ou centrifugada em tubos fechados, durante dez minutos, de modo a obter um líquido sobrenadante límpido.

6.5 - Introduzir, medindo por pipeta, 40 ml da solução límpida no aparelho de arrastamento (5.3) e, eventualmente, 0,5 ml de antiespuma (4.5).

6.6 - Destilar e recolher 200 ml de produto destilado num copo de 250 ml contendo 10,0 ml de ácido sulfúrico 0,5 N (4.4) e 0,1 ml do indicador (4.7).

6.7 - Dosear por retorno o ácido sulfúrico em excesso com a solução de hidróxido de sódio (4.6).

6.8 - No caso de um doseamento potenciométrico, recolher 200 ml de produto destilado num copo de 250 ml contendo 25 ml da solução de ácido ortobórico (4.3) e titular com ácido sulfúrico 0,5 N (4.4).

7 - Expressão dos resultados:
7.1 - Doseamento por retorno com o indicador.
Seja:
V(índice 1)(ml) = o volume da solução de hidróxido de sódio 0,5 N (4.6) utilizado;

T(índice 1) = o título exacto da solução de hidróxido de sódio 0,5 N (4.6);
T(índice 2) = o título exacto da solução de ácido sulfúrico 0,5 N (4.4);
M(mg) = massa da amostra (6.1).
Percentagem (m/m) de NH(índice 3) = ((10T(índice 2) - V(índice 1)T(índice 1)) x 17 x 100)/0,4m = ((10T(índice 2) - V(índice 1)T(índice 1)) x 4250)/m

7.2 - Doseamento potenciométrico directo, em que:
V(índice 2)(ml) = o volume da solução de hidróxido de sódio 0,5 N (4.6) utilizado;

T(índice 1) = o título exacto da solução de hidróxido de sódio 0,5 N (4.6);
T(índice 2) = o título exacto da solução de ácido sulfúrico 0,5 N (4.4);
M(mg) = massa da amostra (6.1).
Percentagem (m/m) de NH(índice 3) = ((10T(índice 2) - V(índice 1)T(índice 1)) x 17 x 100)/0,4m = ((10T(índice 2) - V(índice 1)T(índice 1) x 4250)/m

7.2 - Doseamento potenciométrico directo, em que:
V(índice 2)(ml) = o volume da solução de ácido súlfurico 0,5 N (4.4) utilizado;

T(índice 2) = o título exacto da solução de ácido súlfurico 0,5 N (4.4);
m(mg) = a massa da amostra (6.1).
Percentagem (n/n)de NH(índice 3) = (V(índice 2) x T(índice 2) x 17 x 100)/0,4m = (V(índice 2) x T(índice 2) x 4250)/m

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para o teor em NH(índice 3) da ordem de 6%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,6%.

CAPÍTULO VI
1-(4-aminobenzoato) de glicerol
Identificação e doseamento
A - Identificação
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método destina-se a pôr em evidência o 1-(4-aminobenzoato) de glicerol ou 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo. Permite igualmente identificar o 4-aminobenzoato de etilo (benzocaína DCI) eventualmente presente como impureza.

2 - Princípio:
A identificação faz-se por cromatografia em camada fina de gele de sílica com indicador de fluorescência e caracterização da função amina primária livre por formação sobre a placa de um corante diazóico.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Mistura solvente: ciclo-hexano, isopropanol e diclorometano estabilizado (48:64:9, em volume).

3.2 - Eluente: éter de petróleo, benzeno, acetona e amónia (mínimo 25% NH(índice 3)): (35:35:35:1, em volume).

3.3 - Revelador:
Solução a): nitrito de sódio: 1,0 g em 100 ml de HC1 1 M, a preparar extemporaneamente;

Solução b): 2-naftol: 0,2 g em 100 ml de KOH 1 M.
3.4 - Soluções padrão:
4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo: 0,050 g em 100 ml da mistura solvente (3.1);

4-aminobenzoato de etilo: 0,050 g em 100 ml da mistura solvente (3.1).
3.5 - Placa de gele de sílica 60 F(índice 254), com espessura de 0,25 mm e formato de 20 cm x 20 cm.

4 - Aparelhagem:
4.1 - Equipamento corrente de cromatografia em camada fina.
4.2 - Aparelho vibrador de ultra-sons.
4.3 - Filtro Millipore FH 0,5 (mi)m, ou equivalente.
5 - Técnica:
5.1 - Preparação da amostra:
Pesar 1,5 g da amostra num balão aferido de rolha esmerilada de 10 ml. Completar a 10 ml com a mistura solvente (3.1). Tapar e deixar durante uma hora à temperatura ambiente num aparelho vibrador de ultra-sons (4.2). Filtrar por um filtro Millipore (4.3). Utilizar o filtrado para a cromatografia.

5.2 - Cromatografia em camada fina:
Aplicar sobre a placa (3.5) 10 (mi)l do filtrado (5.1) e 10 (mi)l de cada solução padrão (3.4). Desenvolver o cromatograma no percurso de 15 cm numa tina previamente saturada com o solvente (3.2). Deixar secar à temperatura ambiente.

5.3 - Revelação:
5.3.1 - Observar a placa a luz ultravioleta a 254 nm.
5.3.2 - Sobre a placa perfeitamente seca, vaporizar com a solução 3.3, a). Deixar à temperatura ambiente durante um minuto e vaporizar imediatamente com a solução 3.3, b). Secar a placa na estufa a 60ºC. As manchas aparecem coradas de alaranjado, com os valores de Rf seguintes: 4-aminobenzoato de a-monoglicerilo: 0,07; 4-aminobenzoato de etilo: 0,55.

B - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento do 1-(4-aminobenzoato) de glicerol (4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo). Permite igualmente o dosamento do 4-aminobenzoato de etilo. É o adequado para dosear, no máximo, 5% (m/m) de 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo e 1% (m/m) de 4-aminobenzoato de etilo.

2 - Definição:
O teor em 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo e em 4-aminobenzoato de etilo avaliado por este método e expresso em percentagem de massa [% (m/m)] do produto.

3 - Princípio:
O produto a analisar é posto em suspensão em metanol e, após tratamento adequado, o doseamento é efectuado por cromatografia líquida a alta pressão (HPLC).

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica e, nomeadamente, ser próprios para a cromatografia líquida a alta pressão.

4.1 - Metanol.
4.2 - Di-hidrogeno-ortofosfato de potássio KH(índice 2)PO(índice 4).
4.3 - Acetato de zinco (II) Zn(CH(índice 3)COO)(índice 2) . 2 H(índice 2)O.
4.4 - Ácido acético: (ver documento original).
4.5 - Ferrocianeto de tetrapotássio: K(índice 4) [Fe(CN)(índice 6)] . 3 H(índice 2)O.

4.6 - 4-hidroxibenzoato de etilo.
4.7 - 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo.
4.8 - 4-aminobenzoato de etilo (benzocaína).
4.9 - Solução tampão (0,02 M): dissolver 2,72 g de di-hidrogeno-ortofosfato de potássio (4.2) em 1 l de água.

4.10 - Eluente: solução tampão (4.9) e metanol (4.1) (61:39, em volume). A composição desta fase móvel pode ser modificada de tal modo que o factor de resolução R seja igual ou superior a 1,5:

R = 2 x (d'R(índice 2) - d'R(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
em que:
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos, de dois picos;

W(índice 1) e W(índice 2) = largura, expressa em milímetros, dos mesmos picos a meia altura;

d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
4.11 - Solução mãe de 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo: pesar com precisão cerca de 40 mg de 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo. Introduzi-los num balão aferido de 100 ml. Dissolver em 40 ml de metanol (4.1). Completar o volume com a solução tampão (4.9) e misturar.

4.12 - Solução mãe de 4-aminobenzoato de etilo: pesar com precisão cerca de 40 mg de 4-aminobenzoato de etilo. Introduzi-los num balão aferido de 100 ml. Dissolver em 40 ml de metanol (4.1). Completar o volume com a solução tampão (4.9) e misturar.

4.13 - Solução do padrão interno: pesar com precisão cerca de 50 mg de 4-hidroxibenzoato de etilo (4.6) e dissolvê-los em 40 ml de metanol (4.1). Introduzir a solução num balão aferido de 100 ml, completar o volume com a solução tampão (4.9) e misturar.

4.14 - Soluções padrão: por dissolução em 100 ml de eluente (4.10), preparar quatro soluções padrão conforme o quadro seguinte:

(ver documento original)
4.15 - Solução de Carrez I: dissolver 26,5 g de ferrocianeto tetrapotássico (4.5) em água e completar o volume a 250 ml.

4.16 - Solução de Carrez II: dissolver 54,9 g de acetato de zinco (II) (4.3) e 7,5 ml de ácido acético (4.4) em água e completar a 250 ml.

4.17 - Lichrosorb RP-18, ou equivalente, de 5 (mi)m.
Nota. - Estas soluções podem ser obtidas de modo diferente.
5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Cromatógrafo em fase líquida, a alta pressão, com detector no ultravioleta, com comprimento de onda variável e câmara termostatada a 45ºC.

5.3 - Coluna em ácido inoxidável: comprimento, 250 mm, diâmetro interior, 4,6 mm. A coluna é cheia com Lichrosorb RP-18 (4.17).

5.4 - Banho de ultra-sons.
6 - Técnica:
6.1 - Preparação da amostra:
6.1.1 - Pesar com precisão cerca de 1 g de amostra num copo de 100 ml e juntar 10 ml de metanol (4.1).

6.1.2 - Colocar o copo durante vinte minutos num banho de ultra-sons (5.4). Transferir quantitativamente a suspensão assim obtida para um balão aferido de 100 ml com 75 ml de eluente (4.10), no máximo. Juntar sucessivamente 1 ml de solução de Carrez I (4.15) e 1 ml de solução de Carrez II (4.16), misturando após cada operação. Completar o volume com eluente (4.10), misturar de novo e filtrar por filtro de pregas.

6.1.3 - Com uma pipeta introduzir, num balão aferido de 50 ml, 3,0 ml do filtrado obtido no n.º 6.1.2 e 5,0 ml da solução do padrão interno (4.13). Completar o volume com eluente (4.10) e misturar. Utilizar a solução assim obtida para proceder à análise cromatográfica descrita no n.º 6.2.

6.2 - Cromatografia:
6.2.1 - Regular o débito da fase móvel (4.10) para 1,2 ml/min. e fixar a temperatura da coluna em 45ºC.

6.2.2 - Regular o detector (5.2) em 274 nm.
6.2.3 - Por meio de uma microsseringa, fazer pelo menos duas injecções de 20 (mi)l da solução 6.1.3 e medir a área dos picos.

6.3 - Curvas de calibração:
6.3.1 - Injectar 20 (mi)l de cada uma das soluções padrão (4.14) e medir a área dos picos.

6.3.2 - Para cada concentração, calcular a relação entre a área do pico de 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo e a área do pico do padrão interno. Traçar a curva de calibração colocando esta relação em ordenada e a relação das massas correspondentes em abcissa.

6.3.3 - Proceder do mesmo modo para o 4-aminobenzoato de etilo.
7 - Cálculo:
7.1 - Sobre as curvas da calibração obtidas no n.º 6.3, ler as relações de massa RP(índice 1) e RP(índice 2) correspondentes às relações entre as áreas dos picos calculados no n.º 6.2.3, em que:

RP(índice 1) = relação das massas de 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo e 4-hidroxibenzoato de etilo;

RP(índice 2) = relação das massas de 4-aminobenzoato de etilo e 4-hidroxibenzoato de etilo.

7.2 - A partir das relações de massa assim obtidas, calcular o teor em 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo e em 4-aminobenzoato de etilo, em percentagem de massa (m/m), por meio das fórmulas:

Percentagem (m/m) de 4-aminobenzoato de (alfa)-monobenzoato = RP(índice 1) x q/6p

Percentagem (m/m) de 4-aminobenzoato de estilo = RP(índice 1) x q/6p
em que:
q = quantidade, em miligramas, de 4-aminobenzoato de estilo (padrão interno) pesada no n.º 4.13.

p = quantidade, em gramas, da amostra pesada no n.º 6.1.1.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
8.1 - Para um teor de 5% (m/m) em 4-aminobenzoato de (alfa)-monoglicerilo, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,25%.

8.2 - Para um teor de 1% (m/m) de 4-aminobenzoato de etilo, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,10%.

9 - Notas:
9.1 - Antes de efectuar a análise propriamente dita, é conveniente determinar se a amostra não contém um composto susceptível de coincidir com o pico do padrão interno (4-aminobenzoato de etilo) sobre o cromatograma.

9.2 - Para verificar a ausência de eventuais interferências, repetir o doseamento, modificando em mais ou menos 10% a proporção de metanol na fase móvel.

CAPÍTULO VII
Cloratos de metais alcalinos - Identificação e doseamento
Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve a identificação e o doseamento dos cloratos nos dentifrícios e outros produtos cosméticos.

A - Identificação
1 - Princípio:
Os cloratos são separados dos outros halogenatos por cromatografia em camada fina e detectados por formação de iodo obtido por oxidação do iodeto de potássio.

2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
2.1 - Solução de referência: soluções aquosas de clorato, bromato e iodato de potássio (0,2% m/v) preparadas recentemente.

2.2 - Eluente: solução de amoníaco (28% m/v), acetona e butanol (60:130:30, em volume).

2.3 - Solução aquosa de iodeto de potássio (5% m/v).
2.4 - Solução de amido (1% a 5% m/v).
2.5 - Ácido clorídrico 1 M.
2.6 - Placas de cromatografia em camada fina pré-preparadas revestidas de celulose (espessura: 0,25 mm).

3 - Aparelhagem:
Material corrente de laboratório para cromatografia em camada fina.
4 - Técnica:
4.1 - Extrair cerca de 1 g da amostra com água, filtrar e diluir até cerca de 25 ml.

4.2 - Aplicar sobre a placa (2.6) 2 (mi)l da solução 4.1 e 2 (mi)l de cada uma das três soluções de referência (2.1).

4.3 - Introduzir a placa numa tina e desenvolver por cromatografia ascendente no percurso de cerca de três quartos do comprimento da placa com a ajuda do eluente (2.2).

4.4 - Retirar a placa da tina e deixar evaporar o eluente (duas horas, aproximadamente).

4.5 - Pulverizar a placa com a solução de iodeto de potássio (2.3) e deixar secar durante cerca de cinco minutos.

4.6 - Pulverizar a placa com a solução de amido (2.4) e deixar secar durante cerca de cinco minutos.

4.7 - Pulverizar a placa com ácido clorídrico (2.5).
5 - Avaliação:
Em presença de clorato, aparece uma mancha azul (eventualmente castanha) passada meia hora.

Os valores de Rf são os seguintes:
(ver documento original)
Como os bromatos e os iodatos produzem reacções imediatas, procurar-se-á não confundir as manchas de bromato e de clorato.

B - Doseamento
1 - Definição:
O teor da amostra em clorato determinado por este método é expresso em percentagem de massa de clorato.

2 - Princípio:
O clorato é reduzido por zinco em pó em meio ácido. O cloreto formado é titulado potenciometricamente pelo nitrato de prata. Um doseamento análogo antes da redução permite revelar a presença eventual de halogenetos.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Ácido acético a 80% (m/m).
3.2 - Zinco em pó.
3.3 - Solução titulada de nitrato de prata 0,1 M.
4 - Aparelhagem:
4.1 - Material corrente de laboratório.
4.2 - Potenciómetro equipado com um eléctrodo indicador de prata.
5 - Técnica:
5.1 - Preparação da amostra:
Pesar com precisão uma quantidade (m) de cerca de 2 g num tubo de centrífuga. Juntar cerca de 15 ml de ácido acético (3.1) e misturar cuidadosamente. Esperar trinta minutos e centrifugar durante quinze minutos a 2000 rpm. Transferir a solução sobrenadante para um balão aferido de 50 ml. Repetir duas vezes a centrifugação, juntando 15 ml de ácido acético (3.1) ao resíduo. Recolher as soluções que contêm o clorato no mesmo balão aferido. Completar o volume com ácido acético (3.1).

5.2 - Redução do clorato:
A 20 ml da solução 5.1 juntar 0,6 g de zinco em pó (3.2). Aquecer à ebulição num balão munido de um refrigerante de refluxo. Após trinta minutos de ebulição, deixar arrefecer e filtrar. Lavar o balão com água, filtrar e reunir o filtrado e as águas de lavagem.

5.3 - Doseamento de cloreto:
Titular a solução 5.2 com nitrato de prata (3.3) por meio de potenciómetro (4.2). Titular do mesmo modo 20 ml de solução 5.1 com nitrato de prata (3.3).

Se o produto contiver derivados de bromo ou de iodo susceptíveis de libertar brometos de iodeto após redução, a curva de titulação apresenta vários pontos de inflexão. Neste caso, o volume da solução titulada (3.3) correspondente ao cloreto é representado pela diferença entre os volumes correspondentes aos último e antepenúltimo pontos de inflexão.

6 - Cálculo:
O teor em clorato da amostra é calculado segundo a fórmula:
Percentagem (m/m) de clorato = (20,9(V - V')M)/m
em que:
V = volume, em milímetros, da solução de nitrato de prata (3.3) utilizada para a titulação a solução 5.2;

V' = volume, em milímetros, da solução de nitrato de prata (3.3) utilizada para a titulação da solução 5.1;

M = molaridade da solução de nitrato de prata (3.3);
m = massa, em gramas, da amostra 5.1.
7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em clorato de 3% a 5% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,07% (m/m).

CAPÍTULO VIII
Clorobutanol - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O presente método é o adequado para o doseamento do clorobutanol na concentração máxima 0,5% (m/m) para todos os produtos cosméticos, com excepção dos aerossóis.

2 - Definição:
O teor em clorobutanol avaliado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) do produto.

3 - Princípio:
Após tratamento adequado do produto a analisar, o doseamento é efectuado por cromatografia em fase gasosa, utilizando o 2,2,2-tricloroetanol como padrão interno.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Clorobutanol (1,1,1-tricloro-2-metilpropanol-2).
4.2 - 2,2,2-tricloroetanol.
4.3 - Etanol absoluto.
4.4 - Solução padrão de clorobutanol: 0,025 g em 100 ml de etanol (4.3) (m/v).
4.5 - Solução padrão de 2,2,2-tricloroetanol: 0,004 g em 100 ml de etanol (4.3) (m/v).

5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Cromatógrafo em fase gasosa com detector de captura de electrões 63 Ni.
6 - Técnica:
6.1 - Preparação da amostra:
Pesar com precisão de 0,1 g a 0,3 g de amostra. Introduzi-la num balão aferido de 100 ml, dissolver em etanol (4.3), juntar 1 ml da solução do padrão interno (4.5) e completar o volume com etanol (4.3).

6.2 - Condições da cromatografia em fase gasosa:
6.2.1 - As condições do ensaio devem ser de modo que o factor de resolução R da coluna seja igual ou superior a 1,5:

R = 2 x (d'R(índice 2) - d'R(índice 1))/(W(índice 2))
em que:
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos, de dois picos consecutivos;

W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos picos a meia altura, expressa em milímetros;

d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
6.2.2 - A título de exemplo, as seguintes condições do ensaio permitem o resultado procurado:

(ver documento original)
6.3 - Curva de calibração:
Em cinco balões aferidos de 100 ml, juntar a 1 ml da solução do padrão interno (4.5) respectivamente 0,20 ml, 0,30 ml, 0,40 ml, 0,50 ml e 0,60 ml da solução 4.4 e completar a 100 ml com etanol (4.3). Injectar 1 ml de cada uma destas soluções no cromatógrafo, segundo a técnica descrita no n.º 6.2.2, e traçar a curva de calibração, indicando em abcissa a relação das massa do clorobutanol e do 2,2,2-tricloroetanol e em ordenada a relação das áreas correspondentes.

6.4 - Injectar 1 (mi)l da solução obtida no n.º 6.1 e proceder conforme descrito no n.º 6.2.2.

7 - Cálculo:
7.1 - Calcular a partir da curva de calibração (6.3) a quantidade (a) expressa em microgramas de clorobutanol da solução 6.1.

7.2 - O teor em clorobutanol da amostra em percentagem de massa (m/m) é calculado segundo a fórmula:

Percentagem (m/m) de clorobutanol = (a x 10(elevado 2)/(p x 10(elevado 6) = a/(p x 10(elevado 4)

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em clorobutanol de 0,5% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,01%.

Nota. - Se o resultado for igual ou superior à concentração máxima autorizada, é conveniente verificar a ausência de interferências.

CAPÍTULO IX
Clorofórmio nas pastas dentífricas - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento, por cromatografia em fase gasosa, de clorofórmio nas pastas dentífricas. O limite de quantificação do método é de 5% de clorofórmio.

2 - Definição:
O clorofórmio doseado segundo este método é expresso em percentagem de massa do produto.

3 - Princípio:
Coloca-se a pasta dentífrica em suspensão numa mistura de dimetilformamida e de metanol e junta-se uma certa quantidade de acetonitrilo como padrão interno. Após centrifugação, examina-se uma parte da fase líquida por cromatografia em fase gasosa e calcula-se o teor em clorofórmio.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Porapak Q, ou Chromosorb 101, ou equivalente (80-100 mesh).
4.2 - Acetonitrilo.
4.3 - Clorofórmio.
4.4 - Dimetilformamida.
4.5 - Metanol.
4.6 - Solução de padrão interno:
Pipetar 5 ml de dimetilformamida (4.4) num balão graduado de 50 ml e acrescentar cerca de 300 mg (M), exactamente pesados, de acetonitrilo. Completar até ao traço com a dimetilformamida e misturar.

4.7 - Solução para determinar o factor de resposta relativo:
Pipetar 5 ml de solução de padrão interno (4.6) num balão graduado de 10 ml e acrescentar cerca de 300 mg (M1) de clorofórmio (4.3) exactamente pesados. Completar até ao traço com dimetilformamida e misturar.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Balança analítica.
5.2 - Cromatógrafo de fase gasosa, provido de um detector de ionização de chama.

5.3 - Seringa para injecção de 5 (mi)l ou 10 (mi)l, graduada a um décimo.
5.4 - Pipetas aferidas de 1,4 ml e 5 ml.
5.5 - Balões aferidos de 10 ml e 50 ml.
5.6 - Tubos de ensaio de cerca de 20 ml com tampa de rosca. O interior da tampa é provido de uma placa em matéria plástica com uma das faces revestida a teflon.

5.7 - Centrífuga.
6 - Modo operatório:
6.1 - Condições da cromatografia em fase gasosa:
6.1.1 - Tipo de coluna:
Vidro espiralado;
Comprimento: 150 cm;
Diâmetro interno: 4 mm;
Diâmetro externo: 6 mm.
6.1.2 - Enchimento: Porapak Q, ou Chromosorb 101, ou equivalente (80-100 mesh) (4.1).

6.1.3 - Detector: ionização de chama:
Regular a sua sensibilidade de modo que, após a injecção de 3 (mi)l da solução 4.7, a altura do pico do acetonitrilo atinja cerca de três quartos da totalidade da escala.

6.1.4 - Gás vector: azoto; débito: 65 ml/min.:
Regular o débito dos gases ao nível do detector de ionização de chama, de modo que o débito do ar ou do oxigénio seja 5 a 10 vezes o do hidrogénio.

6.1.5 - Temperaturas:
Injector: 210ºC;
Detector: 210ºC;
Coluna: 175ºC.
6.1.6 - Registador:
Velocidade do papel: cerca de 100 cm/h.
6.2 - Preparação da amostra:
Efectuar a tomada de ensaio a partir de um tubo ainda não aberto. Eliminar um terço do conteúdo, fechar de novo o tubo, misturar cuidadosamente no tubo e colher então a amostra para análise.

6.3 - Doseamento:
6.3.1 - Pesar, com uma precisão de 10 mg, 6 g ou 7 g (M(índice o)) de pasta dentífrica, tratada conforme o n.º 6.2, num tubo com tampa roscada (5.6) e juntar algumas pérolas de vidro.

6.3.2 - Com um pipeta deitar 5,0 ml da solução de padrão interno (4.6), 4 ml de dimetilformamida (4.4) e 1 ml de metanol (4.5) no tubo. Fechar a tampa e homogeneizar.

6.3.3 - Agitar durante meia hora com um agitador mecânico e centrifugar durante quinze minutos o tubo fechado, a uma tal velocidade que se obtenha uma separação nítida das fases.

Nota. - Acontece às vezes que a fase líquida é ainda turva após centrifugação. Neste caso acrescentar 1 g a 2 g de cloreto de sódio à fase líquida e centrifugar de novo.

6.3.4 - Injectar 3 (mi)l desta solução (6.3.3.) nas condições descritas no n.º 6.1. Repetir esta operação.

Nas condições referidas, podemos dar como orientação os seguintes tempos de retenção:

Metanol: cerca de um minuto;
Acetonitrilo: cerca de dois minutos e meio;
Clorofórmio: cerca de seis minutos;
Dimetiformamida: > quinze minutos.
6.3.5 - Determinação do factor de resposta relativo:
Injectar 3 (mi)l de solução 4.7 para determinar o factor de resposta relativo. Repetir esta operação e determinar diariamente o factor de resposta relativo.

7 - Cálculo:
7.1 - Cálculo da resposta relativa:
7.1.1 - Medir as alturas e a largura a meia altura dos picos de acetonitrilo e clorofórmio e calcular a área dos dois picos pela fórmula: altura x largura a meia altura.

7.1.2 - Determinar a área dos picos do acetonitrilo e do clorofórmio nos cromatogramas obtidos no n.º 6.3.5 e calcular a resposta relativa (f(índice s)) através da fórmula:

f(s) = (A(índice s) x M(índice i))/(M(índice s) x A(índice i)) = (A(índice s) x 1/10M)/(A(índice i) x M(índice i))

na qual:
f(índice s) = factor de resposta relativa para o clorofórmio;
A(índice s) = área do pico do clorofórmio (6.3.5);
A(índice i) = área do pico de acetonitrilo (6.3.5);
M(índice s) = quantidade de clorofórmio, em miligramas, por 10 ml da solução utilizada no n.º 6.3.5 (M(índice i));

M(índice i) = quantidade de acetonitrilo, em miligramas, por 10 ml da solução utilizada no n.º 6.3.5 (=1/10 M).

Calcular a média dos valores encontrados.
7.2 - Cálculo do teor em clorofórmio:
7.2.1 - Calcular da maneira descrita no n.º 7.1.1 a área dos picos de clorofórmio e acetonitrilo dos cromatogramas obtidos no n.º 6.3.4.

7.2.2 - Calcular o teor em clorofórmio das pastas dentífricas pela fórmula:
Percentagem X = (A(índice s) x M(índice i))/f(índice s) x M(índice sx) x A(índice i)) x 100% = (A(índice s) x M)/(f(índice s) x A(índice i) x M(índice o) x 100

na qual:
Percentagem X = teor em clorofórmio em percentagem de massa da pasta dentífrica;

A(índice s) = área do pico de clorofórmio (6.3.4);
A(índice i) = área do pico de acetonitrilo (6.3.4);
M(índice sx) = peso, em miligramas, da amostra examinada no n.º 6.3.1 (= 1000 M(índice o);

M(índice i) = quantidade de acetonitrilo, em miligramas, para 10 ml da solução obtida no n.º 6.3.2(1/10 M).

Calcular a média dos teores obtidos e expressar o resultado com aproximação às décimas.

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em clorofórmio de 3% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,3%.

CAPÍTULO X
Compostos de flúor nas pastas dentífricas - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento do flúor total nas pastas dentífricas. É conveniente para teores que não excedam 0,25%.

2 - Definição:
O teor da amostra em flúor determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa (m/m).

3 - Princípio:
O flúor do composto fluorado é transformado em trietilfluorsilano (TEFS) por reacção directa com trietilclorosilano (TECS) em meio ácido e, simultaneamente, extraído com a ajuda de xileno contendo ciclo-hexano como padrão interno. A solução obtida é analisada por cromatografia em fase gasosa.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Fluoreto de sódio seco a 120ºC até massa constante.
4.2 - Água bidestilada ou de qualidade equivalente.
4.3 - Ácido clorídrico concentrado (ver documento original).
4.4 - Ciclo-hexano (CH).
4.5 - Xileno que não dê origem a picos interferentes quando cromatografado nas mesmas condições que as da amostra 6.1. Em caso de necessidade, purificar por destilação (5.8).

4.6 - Trietilclorosilano (TECS Merck, ou equivalente).
4.7 - Soluções padrão de fluoreto.
4.7.1 - Solução padrão de 0,250 mg de fluoreto/ml:
Pesar exactamente 138,1 mg de fluoreto de sódio (4.1) e dissolvê-los em água (4.2). Transferir quantitativamente a solução para um balão aferido de 250 ml (5.5). Completar o volume com água (4.2) e misturar.

4.7.2 - Solução padrão diluída, 0,050 mg de fluoreto/ml. Transferir, com a ajuda de uma pipeta, 20 ml da solução 4.7.1 para um balão aferido de 100 ml (5.5). Completar o volume com água (4.2) e misturar.

4.8 - Solução padrão interno:
Misturar 1 ml de ciclo-hexano (4.4) e 5 ml de xileno (4.5).
4.9 - Solução padrão interno de trietilclorosilano:
Transferir, com a ajuda de uma pipeta (5.7), 0,6 ml de TECS (4.6) e 0,12 ml da solução padrão interno (4.8) para um balão aferido de 10 ml. Completar o volume com xileno (4.5) e misturar. Solução a preparar diariamente.

4.10 - Ácido perclórico a 70% (m/v).
4.11 - Ácido perclórico a 20% (m/v) em água (4.2).
5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Cromatógrafo de fase gasosa munido de um detector de ionização de chama.
5.3 - Homogeneizador Vortex, ou equivalente.
5.4 - Agitador Buhler, tipo SMB1, ou equivalente.
5.5 - Balões aferidos de 100 ml a 250 ml, em polipropileno.
5.6 - Tubos de centrífuga de 20 ml de vidro com tampas de rosca recobertas de teflon Sovirel tipo 611-56, ou equivalente. Limpar os tubos e as tampas da maneira seguinte: mergulhar durante várias horas em ácido perclórico (4.11), lavar cinco vezes com água (4.2) e secar a 100ºC.

5.7 - Pipetas reguláveis susceptíveis de fornecer volumes de 50 (mi)l a 200 (mi)l, com extremidade plástica de utilização única.

5.8 - Aparelho de destilação munido de uma coluna Schneider de três bolas ou de uma coluna de Vigreux equivalente.

6 - Técnica:
6.1 - Análise da amostra:
6.1.1 - Escolher um tubo de pasta dentífrica que ainda não foi aberto. Abrir o tubo. Transferir todo o conteúdo para um recipiente de plástico, misturar cuidadosamente e conservar em condições que impeçam a deterioração.

6.1.2 - Pesar exactamente cerca de 150 mg (m) de amostra num tubo de centrífuga (5.6), juntar 5 ml de água (4.2) e homogeneizar (5.3).

6.1.3 - Juntar 1 ml de xileno (4.5).
6.1.4 - Juntar gota a gota 5 ml de ácido clorídrico (4.3) e homogeneizar (5.3).

6.1.5 - Juntar, com a ajuda de uma pipeta, 0,5 ml de solução do padrão interno de trietilclorosilano (4.9) no tubo de centrífuga (5.6).

6.1.6 - Fechar o tubo de centrífuga por meio da tampa de rosca e misturar cuidadosamente durante quarenta e cinco minutos com a ajuda do agitador (5.4) regulado a 150 vibrações/min.

6.1.7 - Centrifugar durante dez minutos a uma velocidade tal que se obtenha uma separação nítida das fases. Desrolhar o tubo, recolher a fase orgânica e injectar 3 (mi)l na coluna do cromatógrafo de fase gasosa (5.2).

São necessários cerca de vinte minutos para que todos os componentes estejam eluídos.

6.1.8 - Repetir a injecção, calcular a razão média da área dos picos ATEFS/ACH e ler sobre a curva de calibração (6.3) a quantidade de fluoreto correspondente em miligramas (m(índice 1)).

6.1.9 - Calcular o teor em fluoreto total da amostra em percentagem de massa (m/m) de fluoreto como indicado no n.º 7.

6.2 - Condições cromatográficas:
6.2.1 - Coluna:
Natureza: ácido inoxidável;
Comprimento: 180 cm;
Diâmetro: 3 mm;
Enchimento: Gaschrom Q 80-100 mesh;
Fase estacionária: óleo de silicone DC 200 (ou equivalente): 20%.
Estabilizar a coluna durante uma noite a 100ºC, sendo o débito do gás de arrastamento de 25 ml/min. de azoto. Esta operação é repetida todas as noites. Para todas as quatro ou cinco injecções, reestabilizar a coluna por aquecimento durante cerca de meia hora a 100ºC.

Temperatura:
Coluna: 70ºC;
Injector: 150ºC;
Detector: 250ºC;
Gás vector: azoto a 135 ml/min.
6.3 - Curva de calibração:
6.3.1 - Introduzir, com uma pipeta, numa série de seis tubos de centrífuga (5.6), 0 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml e 5 ml da solução padrão de fluoreto diluído (4.7.2). Completar o volume de cada tubo até 5 ml com água (4.2).

6.3.2 - Proceder como indicado nos n.os 6.1.3 a 6.1.6, inclusive.
6.3.3 - Injectar 3 (mi)l de fase orgânica na coluna do cromatógrafo em fase gasosa (5.2).

6.3.4 - Repetir a injecção e calcular a razão média das áreas dos picos ATEFS/ACH.

6.3.5 - Construir uma curva de calibração relacionando a massa de fluoreto (miligramas) nas soluções padrão (6.3.1) e a razão das áreas dos picos ATEFS/ACH medidas no n.º 6.3.4. Traçar a curva de calibração.

7 - Cálculo:
A concentração de flúor total na amostra é obtida pela fórmula seguinte, em percentagem de massa (m/m):

Percentagem (m/m) de fluoreto = m(índice 1)/m x 100
em que:
m = tomada da amostra, em miligramas (6.1.2);
m(índice 1) = quantidade de flúor na curva de calibração, em miligramas (6.1.8).

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor de flúor da ordem de 0,15% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,012%.

CAPÍTULO XI
Compostos organomercuriais - Identificação e doseamento
Objectivo e campo de aplicação:
Este método permite a identificação, nos produtos cosméticos para os olhos, dos derivados organomercuriais utilizados como agentes conservantes.

Aplica-se ao tiomersal (DCI) [2-(etilmercuriotio) benzoato de sódio], bem como ao fenilmercúrio e seus sais.

A - Identificação
1 - Princípio:
Os derivados organomercuriais são complexados sob a forma de ditizonatos. Após extracção dos ditizonatos pelo tetracloreto de carbono, procede-se a uma cromatografia em camada fina em gele de sílica. As manchas de ditizonatos aparecem com cor laranja.

2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
2.1 - Ácido sulfúrico a 25% (v/v).
2.2 - Solução de 1,5-difenil-3-tiocarbazona (ditizona): 0,8 mg de ditizona em 100 ml de tetracloreto de carbono (2.4).

2.3 - Azoto.
2.4 - Tetracloreto de carbono.
2.5 - Eluente: hexano e acetona (90:10, em volume).
2.6 - Soluções padrão a 0,001% em água de:
2-(etilmercuriotio) benzoato;
Cloreto de etilmercúrio ou cloreto de metilmercúrio;
Nitrato ou acetato de fenilmercúrio;
Cloreto de mercúrio (II) ou acetato de mercúrio (II).
2.7 - Placas de sílica G prontas para utilização (Merck 5721, ou equivalente).
2.8 - Cloreto de sódio.
3 - Aparelhagem:
3.1 - Material corrente de laboratório.
3.2 - Equipamento corrente para cromatografia em camada fina.
3.3 - Filtro separador de fases.
4 - Técnica:
4.1 - Extracção:
4.1.1 - Num tubo de centrífuga, diluir, por trituração, 1 g de amostra em 20 ml de água destilada. Dispersar ao máximo aquecendo a 60ºC em banho-maria. Juntar 4 g de cloreto de sódio (2.8), agitar e deixar arrefecer.

4.1.2 - Centrifugar pelo menos durante vinte minutos, a 4500 rpm, de modo a separar a maior parte da fase sólida. Filtrar para uma ampola de decantação e juntar 0,25 ml da solução de ácido sulfúrico (2.1).

4.1.3 - Extrair várias vezes 2 ml ou 3 ml de solução de ditizona (2.2), até que a última fase orgânica fique verde.

4.1.4 - Filtrar por filtro separador de fases (3.3) cada fase orgânica.
4.1.5 - Evaporar à secura sob corrente de azoto (2.3).
4.1.6 - Retomar por 0,5 ml de tetracloreto de carbono (2.4). Aplicar imediatamente esta solução como indicado no n.º 4.2.1.

4.2 - Separação e identificação:
4.2.1 - Aplicar imediatamente sobre a placa de sílica G (2.7) 50 (mi)l da solução em tetracloreto de carbono, obtida no n.º 4.1.6.

Tratar simultaneamente, como indicado no n.º 4.1, 10 ml de solução padrão (2.6) e aplicar sobre a mesma placa 50 (mi)l das soluções obtidas (4.1.6).

4.2.2 - Desenvolver a placa com o eluente (2.5) até uma altura de 15 cm. Os compostos organomercuriais aparecem sob a forma de manchas coradas, cuja coloração é estável, desde que se cubra a placa imediatamente após a evaporação do eluente.

A título indicativo, os Rf obtidos são:
(ver documento original)
B - Doseamento
1 - Definição:
O teor da amostra em composto organomercurial determinado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de mercúrio.

2 - Princípio:
O método consiste num doseamento de mercúrio total. É, pois, necessário ter verificado previamente a ausência de mercúrio mineral e identificar o derivado organomercurial contido na amostra. Após mineralização a húmido, o mercúrio libertado é doseado por absorção atómica sem chama.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Ácido nítrico concentrado (d (elevado 20)(índice 4) = 1,41).
3.2 - Ácido sulfúrico concentrado (d (elevado 20)(índice 4) = 1,84).
3.3 - Água bidestilada.
3.4 - Permanganato de potássio: solução a 7% (m/v).
3.5 - Cloreto de hidroxilamónio: solução a 1,5% (m/v).
3.6 - Peroxodissulfato de dipotássio: solução a 5% (m/v).
3.7 - Dicloreto de estanho: solução a 10% (m/v).
3.8 - Ácido clorídrico concentrado (d (elevado 20)(índice 4) = 1,18).
3.9 - Lã de vidro impregnada de dicloreto de paládio a 1% (m/m).
4 - Aparelhagem:
4.1 - Material corrente de laboratório.
4.2 - Aparelho para doseamento do mercúrio por absorção atómica sem chama (técnica do vapor frio) e respectivo material de vidro. Comprimento mínimo da célula de medida: 10 cm.

5 - Técnica:
Tomar todas as precauções para o doseamento de vestígios de mercúrio.
5.1 - Mineralização.
5.1.1 - Pesar com exactidão cerca de 150 mg (m) de amostra. Juntar 10 ml de ácido nítrico (3.1) e deixar em contacto, durante três horas, em banho-maria a 55ºC num frasco fechado hermeticamente, agitando regularmente. Efectuar simultaneamente um ensaio em branco.

5.1.2 - Depois de arrefecer, juntar 10 ml de ácido sulfúrico (3.2) e voltar a aquecer durante trinta minutos em banho-maria a 55ºC.

5.1.3 - Colocar o balão num banho de gelo fundente e juntar cuidadosamente 20 ml de água (3.3).

5.1.4 - Juntar fracções de 2 ml de uma solução de permanganato de potássio (3.4), até coloração permanente. Colocar durante mais quinze minutos em banho-maria a 55ºC.

5.1.5 - Juntar 4 ml de peroxodissulfato de dipotássio (3.6) e continuar o aquecimento em banho-maria a 55ºC durante trinta minutos.

5.1.6 - Arrefecer e transferir o conteúdo do balão para balão aferido de 100 ml. Lavar com 5 ml de cloreto de hidroxilamónio (3.5) e com quatro vezes 10 ml de água (3.3). O meio deve ser incolor. Completar o volume com água (3.3).

5.2 - Doseamento:
5.2.1 - Introduzir 10 ml da solução de mineralização (5.1.6) no recipiente de vidro usado para doseamento do mercúrio pelo método do vapor frio (4.2). Diluir com 100 ml de água (3.3), juntar 5 ml de ácido sulfúrico (3.2) e 5 ml de dicloreto de estanho (3.7). Misturar após cada adição. Esperar trinta segundos. Os iões Hg++ são reduzidos a mercúrio metálico. Efectuar a determinação. Seja n o número observado.

5.2.2 - Colocar lã de vidro impregnada de dicloreto de paládio (3.9) entre o recipiente de redução e a célula de medida do instrumento (4.2). Repetir a operação 5.2.1. Se n não for igual a zero, a mineralização está incompleta e deve recomeçar-se a análise.

6 - Cálculos:
O teor da amostra, expresso em mercúrio em percentagem de massa (m/m), é calculado pela fórmula:

Percentagem (m/m) de mercúrio = n/m
em que:
n = quantidade de mercúrio, em microgramas, lida no aparelho;
m = massa em miligramas, da tomada de ensaio.
7 - Notas:
7.1 - Para melhorar a mineralização, pode ser necessário proceder previamente a uma diluição da tomada de ensaio.

7.2 - No caso em que se poderia suspeitar de uma fixação do mercúrio por absorção sobre o substracto, será necessário efectuar um doseamento por adição de um padrão.

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para teores em mercúrio de 0,007%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,00035.

CAPÍTULO XII
Corantes de oxidação nas tintas para cabelos
Identificação e doseamento semiquantitativo
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método permite a identificação e o doseamento semiquantitativo das substâncias seguintes nas tintas para cabelos, sob a forma de cremes e líquidos:

(ver documento original)
2 - Princípio:
Os corantes de oxidação são extraídos das tintas, a pH 10, na forma de creme ou de líquido, com etanol a 96º, e identificados por cromatografia em camada fina monodimensional (5) e ou bidimensional (6).

A fim de efectuar o doseamento semiquantitativo das substâncias, comparam-se os cromatogramas das amostras, obtidas através de quatro sistemas de desenvolvimento, com o das soluções dos produtos de referência.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Etanol absoluto.
3.2 - Acetona.
3.3 - Etanol a 96º (v/v).
3.4 - Amónia a 25% (d (elevado 20)(índice 4) = 0,91).
3.5 - L (+) ácido ascórbico.
3.6 - Clorofórmio.
3.7 - Ciclo-hexano.
3.8 - Azoto técnico.
3.9 - Tolueno.
3.10 - Benzeno.
3.11 - 1-butanol.
3.12 - 2-butanol.
3.13 - Ácido hipofosforoso a 50%.
3.14 - Reagente diazóico: poder-se-á utilizar:
Um sal de 4-nitro-1-benzenodiazónio estabilizado pelo ião clorobenzeno-sulfonato, por exemplo (vermelho 2 JN de Francolor, ou equivalente); ou

Um sal de 2-cloro-4-nitro-1-benzenodiazónio estabilizado pelo ião naftalenbenzoato, por exemplo (NNCD Reagent - Ref. n.º 74150 da Fluka, ou equivalente).

3.15 - Nitrato de prata.
3.16 - P-dimetilaminobenzaldeído.
3.17 - 2,5-dimetilfenol.
3.18 - Cloreto férrico . 6H(índice 2)O.
3.19 - Ácido clorídrico a 10% (m/v).
3.20 - Substâncias de referência:
As substâncias de referência são as indicadas no título 1, "Objectivo e campo de aplicação".

No caso de compostos aminados, a substância de referência deve ser constituída exclusivamente pelo cloridrato (mono ou di) ou pela própria base.

3.21 - Soluções de referência a 0,5% (m/v):
Preparar uma solução a 0,5% (m/v) de cada uma das substâncias de referência (3.20).

Pesar 50 mg (mais ou menos) 1 mg de substância de referência num balão aferido de 10 ml.

Juntar 5 ml de etanol a 96º (3.3).
Juntar 250 mg de ácido ascórbico (3.5).
Alcalinizar com a solução amoniacal (3.4) até pH 10 aparente.
Completar a 10 ml com etanol a 96º e misturar.
Notas. - As soluções podem ser conservadas durante uma semana, num local fresco, ao abrigo da luz.

Em certos casos, quando da adição do ácido ascórbico e da amónia, pode produzir-se um precipitado. Convém então deixar depositar antes de efectuar a tomada de ensaio.

3.22 - Eluentes:
3.22.1 - Acetona, clorofórmio e tolueno (35:25:40, em volume).
3.22.2 - Clorofórmio, ciclo-hexano, etanol absoluto e amónia a 25% (80:10:10:1, em volume).

3.22.3 - Benzeno, butanol secundário e água (50:25:25, em volume). Agitar bem a mistura e tomar a fase superior após decantação à temperatura do laboratório (entre 20ºC e 25ºC).

3.22.4 - 1-butanol, clorofórmio e reagente M (7:70:23, em volume). Deixar decantar cuidadosamente a 20ºC-25ºC e tomar a fase inferior.

Preparação do reagente M:
NH(índice 4)OH a 25% (v/v) (3.4): 24 volumes;
Ácido hipofosforoso a 50% (3.13): 1 volume;
H(índice 2)O: 75 volumes.
Nota. - Os eluentes que contêm amoníaco devem ser bem agitados imediatamente antes da utilização.

3.23 - Reveladores:
3.23.1 - Reagente diazóico:
Preparar uma solução aquosa a 5% (m/v) do reagente (3.14) escolhido. Esta solução deve ser preparada no momento da utilização.

3.23.2 - Reagente de Ehrlich:
Dissolver 2 g de p-dimetilaminobenzaldeído (3.16) em 100 ml de ácido clorídrico aquoso a 10% (m/v) (3.19).

3.23.3 - 2,5-dimetilfenol-cloreto férrico . 6H(índice 2)O:
Solução 1: dissolver 1 g de dimetilfenol (3.17) em 100 ml de etanol a 96º (3.3).

Solução 2: dissolver 4 g de cloreto férrico . 6H(índice 2)O (3.18) em 100 ml de etanol a 96º (3.3).

Aquando da revelação pulveriza-se, separadamente, em primeiro lugar a solução 1 e depois a solução 2.

3.23.4 - Nitrato de prata amoniacal:
A uma solução aquosa a 5% (m/v) de nitrato de prata (3.15) juntar amónia a 25% (3.4) até à dissolução do precipitado.

Este reagente deverá ser preparado no momento da sua utilização. Não conservar.

4 - Aparelhagem:
4.1 - Equipamento de laboratório para cromatografia em camada fina.
4.1.1 - Recipiente de plástico ou de vidro permitindo manter a placa de cromatografia em atmosfera de azoto durante a aplicação e até ao desenvolvimento. Esta precaução é necessária, em virtude da grande oxidabilidade de certos corantes.

4.1.2 - Seringa de 10 (mi)ml, graduada de 0,2 (mi)l em 0,2 (mi)l, com uma agulha de secção recta ou, melhor, um repeating dispenser de 50 (mi)l, montado num sistema que permita manter a placa em atmosfera de azoto.

4.1.3 - Placas de sílica pré-preparadas, com a espessura de 0,25 mm e as dimensões de 20 cm x 20 cm (Macherey e Nagel Silice G-HR, ou equivalente).

4.2 - Centrífuga permitindo 4000 rpm.
4.3 - Tubos de centrífuga de 10 ml, com rolha de enroscar.
5 - Técnica:
5.1 - Tratamento das amostras:
Ao abrir o tubo, eliminar os primeiros 2 cm ou 3 cm de creme.
Num tubo de centrífuga (4.3), previamente purgado com azoto, introduzir:
300 mg de ácido ascórbico;
3 g de creme ou 3 g de líquido homogeneizado.
Juntar algumas gotas de amónia (3.4), se o pH for inferior a 10, e completar a 10 ml com etanol a 96º (3.3) Homogeneizar em atmosfera de azoto, tapar e centrifugar a 4000 rpm durante dez minutos. Utilizar a solução sobrenadante.

5.2 - Cromatografia:
5.2.1 - Aplicação:
Aplicar em atmosfera de azoto, sobre uma placa de sílica (4.1.3) e em 9 pontos separados, 1 (mi)l de cada uma das 11 soluções de referência. Estas soluções de referências são referenciadas da seguinte forma:

(ver documento original)
Por outro lado, colocar sobre cada um dos 10.º e 11.º pontos 2 ml das soluções das amostras obtidas no n.º 5.1.

Conservar a placa em atmosfera de azoto até ao momento em que a mesma for cromatografada.

5.2.2 - Desenvolvimento:
Introduzir a placa numa tina previamente purgada com azoto, saturada com um dos quatro eluentes adequados (3.22), e deixar desenvolver à temperatura ambiente (20ºC a 25ºC) e na obscuridade no percurso de 15 cm.

Tirar a placa e secá-la em atmosfera de azoto à temperatura ambiente.
5.2.3 - Revelação:
Pulverizar imediatamente a placa com um dos quatro reveladores referidos no n.º 3.23.

5.2.4 - Identificação:
Comparam-se os Rf e as colorações obtidas para a amostra com as das substâncias de referência aplicadas. O quadro I dá, a título informativo, os valores de Rf e as colorações obtidas para cada substância de referência, em função do eluente e dos reveladores.

Em caso de identificação duvidosa, pode obter-se, por vezes, uma confirmação, juntando à amostra a substância de referência correspondente.

5.2.5 - Doseamento semiquantitativo:
Comparar visualmente a intensidade das manchas correspondentes a cada substância identificada no n.º 5.2.4 com uma gama padrão de concentrações conhecidas e adequadas, obtidas a partir da substância de referência correspondente.

Quando a concentração do componente da amostra é demasiado alta, diluir a solução a aplicar e efectuar um novo doseamento.

QUADRO I
Valores de Rf e colorações obtidas imediatamente após a revelação
(ver documento original)
6 - Exame por cromatografia em camada fina bidimensional:
A cromatografia em camada fina bidimensional descrita necessita dos seguintes reagentes:

6.1 - Substâncias e soluções da referência:
6.1.1 - (beta)-naftol ((beta)-N).

6.1.2 - 2-aminofenol (OAF).
6.1.3 - 3-aminofenol (MAF).
6.1.4 - 4-aminofenol (PAF).
6.1.5 - 2-nitro-p-fenilenodiamina (2-NPFD).
6.1.6 - 4-nitro-o-fenilenodiamina (4-NOFD):
Preparar uma solução a 0,5% (m/v) de cada uma das substâncias de referências suplementares como se indica no n.º 3.2.1.

6.2 - Eluente:
6.2.1 - Acetato de etilo, ciclo-hexano e amónia a 25% (65:35:0,5, em volume).
6.3 - Revelador:
Colocar um recipiente de vidro numa tina de desenvolvimento para cromatografia em camada fina com 2 g de iodo cristalizado e fechar a tina.

6.4 - Cromatografar:
6.4.1 - Traçar, como se indica na figura 1, duas linhas sobre a camada absorvente de uma placa de cromatografia em camada fina (4.1.3).

6.4.2 - Depositar, sob corrente de azoto, no ponto de partida 1 (figura 1), 1 (mi)l a 4 (mi)l do extracto 5.1. A quantidade depende da intensidade das manchas obtidas no cromatograma (5.2).

6.4.3 - Depositar, entre os pontos 2 e 3 (figura 1), os corantes de oxidação identificados (ou supostamente identificados) no n.º 5.2. Distância entre os pontos: 1,5 cm. Depositar 2 (mi)l de cada uma das soluções de referência, à excepção do DAF, de que é necessário depositar 6 (mi)l. A operação é executada em atmosfera de azoto.

6.4.4 - Recomeçar a operação descrita no n.º 6.4.3 para os pontos de partida 4 e 5 (figura 1) e conservar a placa em atmosfera de azoto até à cromatografia.

6.4.5 - Purgar uma tina de cromatografia com azoto e introduzir uma quantidade adequada de eluente (3.22.2). Colocar a placa (6.4.4) na tina e cromatografar na primeira direcção de eluição (figura 1) na obscuridade. Cromatografar no percurso de, pelo menos, 13 cm.

6.4.6 - Retirar a placa da tina e colocá-la na tina purgada com azoto (4.1), para evaporar os restos de eluente (durante, pelo menos, sessenta minutos).

6.4.7 - Introduzir, com uma proveta graduada, uma quantidade adequada de eluente (6.2.1) numa tina purgada com azoto, colocando a placa rodada de 90º relativamente à primeira direcção de eluição (6.4.6) na tina e cromatografar nesta segunda direcção na obscuridade até que a frente do solvente tenha atingido a linha traçada previamente sobre a camada absorvente. Tirar a placa da tina e evaporar o eluente ao ar.

6.4.8 - Expor a placa durante dez minutos, na tina de cromatografia, aos vapores de iodo (6.3) e interpretar o cromatograma bidimensional com a ajuda das substâncias de referência cromatografadas ao mesmo tempo (quadro II).

Nota. - Para obter uma coloração máxima das manchas, deixar o cromatograma ao ar durante meia hora após a revelação.

6.4.9 - A presença dos corantes de oxidação encontrados no n.º 6.4.8 pode ser confirmada de modo indubitável, recomeçando as operações descritas nos n.os 6.4.1 a 6.4.8, inclusive, admitindo a adição no ponto de partida 1, além da quantidade de extracto indicado no n.º 6.4.2, de 1 (mi)l das substâncias de referência identificadas no n.º 6.4.8.

Se não for encontrada qualquer outra mancha, confirma-se a interpretação do primeiro cromatograma.

QUADRO II
Cor das substâncias de referência após cromatografia e revelação pelos vapores de iodo

(ver documento original)
CAPÍTULO XIII
Diclorometano e 1,1,1-tricloroetano - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento do diclorometano (cloreto de metileno) e do 1,1,1-tricloroetano (metilclorofórmio). Aplica-se aos produtos cosméticos susceptíveis de conter estes produtos.

2 - Definição:
O teor da amostra em diclorometano e em 1,1,1-tricloroetano determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa (m/m).

3 - Princípio:
O doseamento efectua-se por cromatografia em fase gasosa, utilizando o triclorometano (clorofórmio) como padrão interno.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Triclorometano (CH Cl(índice 3)).
4.2 - Tetracloreto de carbono (CCl(índice 4)).
4.3 - Diclorometano (CH(índice 2) Cl(índice 2)).
4.4 - 1,1,1-tricloroetano (CH(índice 2) Cl(índice 2)).
4.5 - Acetona.
4.6 - Azoto.
5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório e de cromatografia em fase gasosa.
5.2 - Cromatógrafo munido de um detector catarométrico.
5.3 - Dispositivo de recolha de 50 ml-100 ml (v. em "Tratamento das amostras para laboratório", n.º 5.3).

5.4 - Seringa para gases, sob pressão (v. em "Tratamento das amostras para laboratório", n.º 5.4.22).

6 - Técnica:
6.1 - Amostra não pressurizada: pesar exactamente a amostra num matrás com rolha. Introduzir uma quantidade, pesada com exactidão, de CH Cl(índice 3) (4.1) equivalente à quantidade pressuposta de CH(índice 2) Cl(índice 2) e CH(índice 3) CCl(índice 3) contida na amostra e homogeneizar.

6.2 - Amostra pressurizada: utilizar o método para a tomada de ensaio descrito no capítulo "Amostragem". Todavia, ter o maior cuidado com a precisão das indicações seguintes.

6.2.1 - Introduzir no dispositivo de recolha (5.3) uma quantidade de padrão interno (4.1) equivalente à quantidade pressuposta de CH(índice 2) Cl(índice 2) e ou CH(índice 3) CCl(índice 3) contida na amostra. Homogeneizar. Lavar o "volume morto" da válvula do dispositivo de recolha (5.3) com 0,5 ml de CCl(índice 4) (4.2), que se deixa evaporar. Determinar a massa do padrão interno por pesagem diferencial do dispositivo de recolha (5.3).

6.2.2 - A ponta em teflon da seringa, após enchimento com a amostra, deve ser submetida a uma corrente de azoto (4.6), de tal modo que antes da injecção no cromatógrafo não subsista qualquer resíduo da amostra.

6.2.3 - Após cada aplicação, a ponta da válvula ou eventual peça de transferência utilizada deve ser lavada várias vezes com acetona (4.5) (com uma seringa hipodérmica) e em seguida bem seca com azoto (4.6).

6.2.4 - Para cada análise, proceder às determinações utilizando dois dispositivos de recolha (5.3) diferentes, efectuando cinco medidas por dispositivo.

7 - Condições cromatográficas:
7.1 - Pré-coluna:
Tubo inoxidável;
Comprimento: 30 cm;
Diâmetro: 3 mm ou 6 mm;
Enchimento: Chromosorb com as mesmas características que o da coluna.
7.2 - Coluna:
A fase estacionária é constituída por Halicomid M 18 em Chromosorb. Deve permitir um grau de resolução (R) igual a 1,5, pelo menos:

R = 2 x (d'r(índice 2) - d'r(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
em que:
r(índice 1) e r(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos;
W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos picos a meia altura, em milímetros;
d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
7.3 - A título de exemplo, indicam-se as seguintes condições operatórias:
(ver documento original)
8 - Determinação dos coeficientes de proporcionalidade:
Preparar num matrás a mistura seguinte, pesada com exactidão:
CH(índice 2) Cl(índice 2) (4.3): 30% (m/m) de diclorometano;
CH(índice 3) CCl(índice 3) (4.4): 35% (m/m) de tricloroetano;
CH Cl(índice 3) (4.1): 35% (m/m) de triclorometano.
Serve para estabelecer os coeficientes de proporcionalidade.
9 - Cálculos:
9.1 - Cálculo de um coeficiente de porporcionalidade de uma substância p em relação a uma substância a escolhida como padrão interno.

Considerando a substância p:
k(índice p) = o seu coeficiente de proporcionalidade;
m(índice p) = a sua massa na mistura;
A(índice p) = a área do seu pico.
Considerando a substância a:
k(índice a) = o seu coeficiente de proporcionalidade, considerado igual a 1;
m(índice a) = a sua massa na mistura;
A(índice a) = a área do seu pico.
k(índice p) = (m(índice p) x A(índice a))/(m(índice a) x A(índice p))
A título de exemplo, foram obtidos os coeficientes de proporcionalidade seguintes (para CH Cl(índice 3): k = 1):

CH(índice 2) Cl(índice 2): k(índice 1) = 0,78 (mais ou menos) 0,03
CH(índice 3) CCl(índice 3): k(índice 2) = 1,00 (mais ou menos) 0,03
9.2 - Cálculo das percentagens de CH(índice 2) Cl(índice 2) e CH(índice 3) CCl(índice 3) presentes na amostra a analisar, em que:

k(índice 1) = o coeficiente de proporcionalidade de CH(índice 2) Cl(índice 2);
k(índice 2) = o coeficiente de proporcionalidade de CH(índice 3) CCl(índice 3);

m(índice a) = a massa de CH Cl(índice 3);
m(índice e) = a massa da amostra a analisar;
A(índice a) = a área do pico de CH Cl(índice 3);
A(índice 1) = a área do pico de CH(índice 2) Cl(índice 2);
A(índice 2) = a área do pico de CH(índice 3) CCl(índice 3).
Teremos:
Percentagem (m/m) de diclorometano = (m(índice a) x A(índice 1) x k(índice 1) x 100)/(A(índice a) x m(índice e))

Percentagem (m/m) de triclorometano = (m(índice a) x A(índice 2) x k(índice 2) x 100)/(A(índice a) x m(índice e))

10 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em compostos clorados de 25% (m/m), a diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 2,5%.

CAPÍTULO XIV
Formaldeído livre - Identificação e doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método compreende uma identificação e dois doseamentos, consoante estejam ou não presentes libertadores de formaldeído. É aplicável a todos os produtos cosméticos.

1.1 - Identificação:
1.2 - Doseamento global por colorimetria com acetilacetona:
Este método aplica-se quando o formaldeído é utilizado isolado ou com outros conservantes não libertadores de formaldeído.

Em caso contrário, e se o resultado ultrapassar a concentração máxima autorizada no produto acabado, utiliza-se o método de confirmação seguinte.

1.3 - Doseamento em presença de libertadores de formaldeído:
No método precedente, durante a derivação os libertadores de formaldeído são clivados e conduzem a resultados demasiado elevados (formaldeído livre e combinado).

É imperioso separar o formaldeído livre por cromatografia líquida.
2 - Definição:
O teor da amostra em formaldeído livre determinado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de formaldeído.

3 - Identificação:
3.1 - Princípio:
O formaldeído livre e combinado, em meio sulfúrico, confere uma coloração rosa ou malva em presença do reagente de Schiff.

3.2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica e a água desmineralizada.
3.2.1 - Fucsina.
3.2.2 - Sulfito de sódio hepta-hidratado.
3.2.3 - Ácido clorídrico concentrado (ver documento original).
3.2.4 - Ácido sulfúrico 1 M, aproximadamente.
3.2.5 - Reagente de Schiff:
Num copo, pesar 100 mg de fucsina (3.2.1) e dissolver em 75 ml de água a 80ºC.
Após arrefecimento, acrescentar 2,5 g de sulfito de sódio (3.2.2) e 1,5 ml de ácido clorídrico (3.2.3).

Completar até 100 ml.
Duração de conservação: duas semanas.
3.3 - Técnica:
3.3.1 - Num copo de 10 ml introduzir cerca de 2 g de amostra.
3.3.2 - Juntar duas gotas de H(índice 2)SO(índice 4) (3.2.4) e 2 ml de reagente de Schiff (3.2.5).

Este reagente deve estar rigorosamente incolor no momento da utilização. Agitar e deixar em contacto cinco minutos.

3.3.3 - Se em cinco minutos se observar uma coloração rosa ou malva, a quantidade de formaldeído presente é superior a 0,01%. Efectuar então o doseamento do formaldeído livre e combinado segundo o n.º 4 e, se necessário, o n.º 5.

4 - Doseamento global por colorimetria com acetilacetona:
4.1 - Princípio:
O formaldeído reage com acetilacetona em presença do acetato de amónio para formar a 3-5-diacetil-1-4-di-hidrolutidina. Esta é extraída com 1-butanol. A absorvência do extracto é determinada a 410 nm.

4.2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica e a água desmineralizada.
4.2.1 - Acetato de amónio anidro.
4.2.2 - Ácido acético concentrado (d(elevado 20) (índice 4) = 1,05).
4.2.3 - Acetilacetona recentemente destilada a pressão reduzida (25 mm Hg 25ºC) e que não deve apresentar qualquer absorção a 410 nm.

4.2.4 - 1-butanol.
4.2.5 - Ácido clorídrico 1 M.
4.2.6 - Ácido clorídrico 0,1 M, aproximadamente.
4.2.7 - Hidróxido de sódio 1 M.
4.2.8 - Cozimento de amido recentemente preparado de acordo com a Farmacopeia Portuguesa, 5.ª ed., 1986, parte I (1 g/50 ml de água).

4.2.9 - Formaldeído a 37%-40%.
4.2.10 - Solução titulada de iodo 0,05 M.
4.2.11 - Solução titulada de tiossulfato de sódio 0,1 M.
4.2.12 - Reagente de acetilacetona:
Num balão aferido de 1000 ml dissolver:
150 g de acetato de amónio (4.2.1);
2 ml de acetilacetona (4.2.3);
3 ml de ácido acético (4.2.2).
Completar até 1000 ml com água (pH da solução: 6,4 aproximadamente).
Este reagente deve ser preparado na altura.
4.2.13 - Reagente (4.2.12) sem acetilacetona.
4.2.14 - Formaldeído padrão: solução mãe:
Num balão aferido de 1000 ml introduzir 5 g de formaldeído (4.2.9) e completar com água até 1000 ml.

Determinação do título da solução mãe:
Tomar 10,00 ml, adicionar 25,00 ml de solução titulada de iodo (4.2.10) e 10 ml de solução de hidróxido de sódio (4.2.7). Deixar repousar durante cinco minutos. Acidificar com 11 ml de HCl (4.2.5) e dosear o iodo em excesso com uma solução titulada de tiossulfato de sódio (4.2.11), em presença de cozimento de amido como indicador.

1 ml desta solução de iodo (4.2.10) consumida corresponde a 1,5 mg de formaldeído.

4.2.15 - Formaldeído padrão - solução diluída:
Efectuar sucessivamente uma diluição 1/20 e depois uma diluição 1/100 da solução mãe em água.

1 ml desta solução mãe contém cerca de 1 (mi)g de formaldeído. Calcular o seu teor exacto.

4.3 - Aparelhos e utensílios:
4.3.1 - Material corrente de laboratório:
4.3.2 - Filtro separador de fase, ref. Whatman 1 PS (ou equivalente).
4.3.3 - Centrifugadora.
4.3.4 - Banho-maria regulado a 60ºC.
4.3.5 - Espectrofotómetro.
4.3.6 - Tinas de vidro de 1 cm de percurso óptico.
4.4 - Técnica:
4.4.1 - Solução amostra:
Pesar com a precisão de 0,001 g uma quantidade de amostra correspondente a cerca de 150 (mi)g de formaldeído. Transferir para um balão aferido de 100 ml. Completar até 100 ml com água e misturar (solução S). Verificar se o pH é próximo de 6; caso contrário, efectuar a diluição na solução de ácido clorídrico (4.2.6).

Num balão de Erlenmeyer de 50 ml juntar:
10,0 ml de solução S;
5,0 ml de reagente de acetilacetona (4.2.12) e água, até um volume de 30 ml.
4.4.2 - Solução testemunha:
A interferência eventual de uma coloração de fundo na amostra de ensaio é eliminada da seguinte forma:

Num balão de Erlenmeyer de 50 ml juntar:
10,0 ml da solução S;
5,0 ml de reagente (4.2.13) e água, até um volume de 30 ml.
4.4.3 - Ensaio a branco:
Num balão de Erlenmeyer de 50 ml juntar 5,0 ml de reagente de acetilacetona (4.2.12) e água, até um volume de 30 ml.

4.4.4 - Doseamento:
4.4.4.1 - Agitar as misturas preparadas nos n.os 4.4.1, 4.4.2 e 4.4.3. Mergulhar os balões em banho-maria a 60ºC durante exactamente dez minutos. Arrefecer durante dois minutos num banho de água gelada.

4.4.4.2 - Transferir para uma ampola de decantação de 50 ml contendo exactamente 10 ml de 1-butanol (4.2.4). Lavar com 3 ml a 5 ml de água. Agitar fortemente a mistura durante trinta segundos exactos. Deixar decantar.

4.4.4.3 - Filtrar a fase butanólica por filtro separador de fase (4.3.2) para tinas do espectrofotómetro.

Pode também recorrer-se a uma centrifugação (300 rpm durante cinco minutos).
4.4.4.4 - Determinar a absorvência A(índice 1) a 410 nm do extracto da solução amostra obtida no n.º 4.4.1 em relação ao extracto da solução testemunha (4.4.2).

4.4.4.5 - Da mesma forma, determinar a absorvência A(índice 2) do extracto do ensaio em branco obtido no n.º 4.4.3 em relação a 1-butanol.

N. B. - Todas estas operações devem ser executadas num período de vinte e cinco minutos a partir do momento em que o balão é colocado em banho-maria a 60ºC.

4.4.5 - Curva de calibração:
4.4.5.1 - Num balão de Erlenmeyer de 50 ml juntar:
5,0 ml de solução padrão diluída (4.2.15);
5,0 ml de reagente de acetilacetona (4.2.12) e água, até um volume final de 30 ml.

4.4.5.2 - Continuar segundo as indicações (4.4.4) e determinar a absorvência em relação ao 1-butanol (4.2.4).

4.4.5.3 - Repetir o processo com 10 ml, 15 ml, 20 ml e 25 ml de solução padrão diluída (4.2.15).

4.4.5.4 - Para obter o valor do ponto 0 (correspondente a coloração dos reagentes), proceder como no n.º 4.4.4.5.

4.4.5.5 - Construir a curva de calibração após subtracção do valor do ponto 0 de cada uma das absorvências obtidas nos n.os 4.4.5.1 e 4.4.5.3.

A lei de Beer aplica-se até 30 (mi)g de formaldeído.
4.5 - Cálculos:
4.5.1 - Subtrair A(índice 2) de A(índice 1) e ler sobre a curva de calibração (4.4.5.5) a quantidade C, expressa em microgramas, de formaldeído contido na solução 4.4.1.

4.5.2 - O teor em formaldeído da amostra em percentagem de massa (m/m) é calculado segundo a fórmula:

Formaldeído (%) = C/(10(elevado 3) x m)
4.6 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em formaldeído de 0,2%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não dever ultrapassar 0,005% para o doseamento colorimétrico com acetilacetona.

Se o doseamento do formaldeído conduzir a resultados superiores aos previstos na Portaria 613/87, de 16 de Julho, a saber:

a) Compreendidos entre 0,05% e 0,2%, quando não indicado no rótulo;
b) Superiores a 0,2%, quando indicado ou não no rótulo;
é obrigatório proceder segundo o método descrito n.º 5.
5 - Doseamento em presença de libertadores de formaldeído:
5.1 - Princípio:
O formaldeído separado é transformado em derivado lutidínico amarelo por reacção com a acetilacetona num reactor pós-coluna. O derivado formado é doseado por espectrofotometria a 420 nm.

5.2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica e a água desmineralizada.
5.2.1 - Água de qualidade HPLC.
5.2.2 - Acetato de amónio anidro.
5.2.3 - Ácido acético (d(elevado 20)(índice 4)).
5.2.4 - Acetilacetona (conservada a 4ºC).
5.2.5 - Fosfato dissódico anidro.
5.2.6 - Ácido ortofosfórico a 85% (d(elevado 20)(índice 4)).
5.2.7 - Metanol.
5.2.8 - Diclorometano.
5.2.9 - Formaldeído a 37%-40%.
5.2.10 - Hidróxido de sódio 1 M.
5.2.11 - Ácido clorídrico 1 M.
5.2.12 - Ácido clorídrico 0,002 M.
5.2.13 - Cozimento de amido recentemente preparado de acordo com a Farmacopeia Portuguesa.

5.2.14 - Solução titulada de iodo 0,05 M.
5.2.15 - Solução titulada de tiossulfato de sódio 0,1 M.
5.2.16 - Fase móvel:
Solução aquosa de fosfato dissódico (5.2.5) 0,006 M ajustado a um pH 2,1 com ácido ortofosfórico (5.2.6).

5.2.17 - Reagente pós-coluna:
Dissolver num balão aferido de 1000 ml:
62,5 g de acetato de amónio (5.2.2);
7,5 ml de ácido acético (5.2.3);
5 ml de acetilacetona (5.2.4).
Completar até 1000 ml com água (5.2.1). Manter o reagente ao abrigo da luz. Conservação: máximo de três dias a 25ºC. Não deve verificar-se alteração da cor.

5.2.18 - Formaldeído padrão - solução mãe:
Num balão aferido de 1000 ml introduzir 10 g de formaldeído (5.2.9) e completar com água até 1000 ml.

Determinação do título da solução mãe:
Tomar 5,0 ml, adicionar 25,0 ml da solução titulada de iodo (5.2.14) e 10 ml de solução de hidróxido de sódio (5.2.10). Deixar repousar durante cinco minutos. Acidificar com 11,0 ml de HCl (5.2.11) e dosear o iodo em excesso com uma solução titulada de tiossulfato de sódio (5.2.15), em presença de cozimento de amido (5.2.13) como indicador.

1 ml de solução de iodo (5.2.14) consumida corresponde a 1,5 mg de formaldeído.

5.2.19 - Formaldeído padrão - solução diluída:
Efectuar uma diluição a 1/100 da solução-mãe na fase móvel (5.2.16).
1 ml desta solução contém cerca de 37 (mi)g de formaldeído; calcular o seu teor exacto.

5.3 - Aparelhos:
5.3.1 - Material corrente de laboratório.
5.3.2 - Uma bomba HPLC sem pulsações.
5.3.3 - Uma bomba de baixa pressão sem pulsações para o reagente (ou uma segunda bomba HPLC com as mesmas características da primeira).

5.3.4 - Uma válvula de injecção munida de uma ansa de 10 (mi)l.
5.3.5 - Reactor pós-coluna com os seguintes elementos:
Um balão de três tubuladuras de 1 l;
Um aquecedor de balões de 1 l;
Duas colunas Vigreux com um mínimo de 10 patamares (refrigerante a ar);
Um tubo inox (para permuta térmica) - (diâmetro) ext.: 1,6 mm; (diâmetro) int.: 0,23 mm; comprimento: 400 mm;

Tubo de teflon - (diâmetro) ext.: 1,6 mm; (diâmetro) int.: 0,30 mm; comprimento: 5 m (tricotin) (v. anexo 1);

Um "T" sem volume morto (Valco, ou equivalente);
Três junções Union sem volume morto, ou um módulo pós-coluna do tipo Applied Biosystems PCRS 520, ou equivalente, munido de um reactor de 1 ml.

5.3.6 - Membrana filtrante de 0,45 (mi).
5.3.7 - Cartucho Seppak RC(índice 18) (ou equivalente).
5.3.8 - Colunas prontas para uso:
Bischoff hypersil RP 18 (tipo NC, ref. C 25.46 1805) (5 (mi); comprimento: 250 mm; (diâmetro) int.: 4,6 mm), ou Dupont, Zorbax ODS (5 (mi); comprimento: 250 mm; (diâmetro) int.: 4,6 mm), ou Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 (mi); comprimento: 250 mm; (diâmetro) int.: 4,0 mm).

5.3.9 - Pré-coluna:
Bischoff K1 hypersil RP 18 (ref. K1 G 6301 1805), ou equivalente (5 (mi); comprimento: 10 mm).

5.3.10 - A coluna e a pré-coluna são ligadas por um sistema Ecotube (ref. A 15020508 Bischoff), ou equivalente.

5.3.11 - Efectuar a montagem (5.3.5) segundo o esquema do anexo 2.
As ligações a seguir à válvula de injecção devem ser o mais curtas possível. Neste caso, o tubo inox colocado entre a saída do reactor e a entrada do detector tem por objectivo arrefecer a mistura antes da detecção. A temperatura dentro do detector não é conhecida, mas é constante.

5.3.12 - Detector de UV/visível.
5.3.13 - Registador.
5.3.14 - Centrifugadora.
5.3.15 - Banho de ultra-sons.
5.3.16 - Agitador (tipo Vortex, ou equivalente).
5.4 - Técnica:
5.4.1 - Curva de calibração:
Obtém-se medindo a altura dos picos em função da concentração. As soluções padrão obtêm-se por diluição da solução diluída de formaldeído padrão (5.2.19) na fase móvel (5.2.16):

1,0 ml de solução padrão (5.2.19) diluída a 20,0 ml: cerca de 185 (mi)g/100 ml;

2,0 ml de solução padrão (5.2.19) diluída a 20,0 ml: cerca de 370 (mi)g/100 ml;

5,0 ml de solução padrão (5.2.19) diluída a 25,0 ml: cerca de 740 (mi)g/100 ml;

5,0 ml de solução padrão (5.2.19) diluída a 20,0 ml: cerca de 925 (mi)g/100 ml.

As soluções padrão são guardadas durante uma hora à temperatura do laboratório e devem ser preparadas no momento. A linearidade da curva de calibração é adequada para concentrações de 1,00 (mi)g/ml a 15,00 (mi)g/ml.

5.4.2 - Preparação de amostras:
5.4.2.1 - Emulsões (cremes, bases, eyeliners):
Pesar, com a precisão de 0,001 g, uma quantidade de amostra correspondente a cerca de 100 (mi)g de formaldeído. Transferir para tubo de centrífuga de 100 ml. Juntar 20 ml de diclorometano (5.2.8) e 20,0 ml de ácido clorídrico (5.2.12). Misturar utilizando o agitador (5.3.16) e ultra-sons (5.3.15). Separar as duas fases por centrifugação (3000 rpm durante dois minutos). À parte, lavar um cartucho (5.3.7) com 2 ml de metanol (5.2.7) e condicioná-lo com 5 ml de água (5.2.1). Fazer passar 4 ml da fase aquosa do extracto através do cartucho condicionado, eliminar os primeiros 2 ml e recuperar a fracção seguinte.

5.4.2.2 - Loções e champôs:
Pesar, com a precisão de 0,001 g, uma quantidade de amostra correspondente a cerca de 100 (mi)g de formaldeído. Transferir para um balão volumétrico de 100 ml. Completar até 100 ml com a fase móvel (5.2.16). A solução é filtrada através da membrana filtrante (5.3.6) e injectada ou passada através de um cartucho (5.3.7) condicionado como no n.º 5.4.2.1.

Todas as soluções devem ser injectadas imediatamente.
5.4.3 - Condições cromatográficas:
Débito da fase móvel: 1 ml/min.;
Débito do reagente: 0,5 ml/min.;
Débito total à saída do detector: 1,5 ml/min.;
Volume injectado: 10 (mi)l;
Temperatura de eluição: nas separações difíceis, a coluna é imersa num banho de gelo em fusão - aguardar que as temperaturas se equilibrem (quinze a vinte minutos);

Temperatura de reacção pós-coluna: 100ºC;
Detecção: 420 nm.
N. B. - O conjunto do sistema cromatográfico e pós-coluna deve ser lavado com água (5.2.1) depois da utilização. No caso de uma interrupção superior a dois dias, esta lavagem deve ser seguida de uma lavagem com metanol. Antes de recondicionar o sistema, passá-lo por água, para evitar recristalizações.

5.5 - Cálculos:
Teor em formaldeído em percentagem de massa (m/m):
(C x 10(elevado -6) x 100)/5m = (C x 10(elevado -4))/5m
Loções e champôs (5.4.2.2):
Teor em formaldeído:
(C x 10(elevado -6) x 100)/m = (C x 10(elevado -4)/m
em que:
m = massa, em gramas, da amostra submetida em análise;
C = concentração, em microgramas/100 ml, de formaldeído lida na curva da calibração (5.4.1).

5.6 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em formaldeído de 0,05%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,001%.

Para um teor em formaldeído de 0,2%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,005%.

ANEXO 1
Construção de um tricotin
Acessórios utilizados para construção do tricotin:
Um cilindro de madeira:
Diâmetro externo de 5 cm; no meio do cilindro é feito um furo de 1,5 cm. Pregam-se quatro puas de aço de forma a ficarem equidistantes (v. o esquema do cilindro - figuras 1 e 2). Distância entre duas puas: 1,8 cm. Distância entre uma pua e o furo central: 0,5 cm;

Uma haste rígida (de tipo agulha de crochet) para fazer as laçadas a partir do tubo de teflon;

Tubo de teflon - (diâmetro) ext.: 1,6 mm; (diâmetro) int.: 0,3 mm; comprimento: 5 m.

Funcionamento do tricotin:
Para fazer funcionar o tricotin é necessário enfiar o tubo de teflon de cima para baixo através do tubo central do cilindro (deixando sair pela face inferior cerca de 10 cm de tubo, o que permitirá puxar ligeiramente o cordão que vai sendo confeccionado) e enrolar o tubo à volta de cada uma das quatro puas para efectuar a primeira volta (v. figura 3).

A entrada e a saída do tricotin são providas de casquilho e parafusos de pressão: é necessário ter cuidado para não esmagar o teflon durante a montagem.

A partir da segunda volta fazer passar o tubo pelo exterior de cada pua, para em seguida formar uma laçada da seguinte forma: fazer passar o tubo da volta inferior sobre o tubo da volta superior com a ajuda da haste rígida (v. figura 4).

Este trabalho deve ser repetido para cada uma das puas respeitando a ordem 1-2-3-4, até se obterem os 5 m ou o comprimento desejado. Deixar cerca de 10 cm de tubo para fechar o cordão. Passar o tubo por dentro de cada uma das quatro laçadas e puxar ligeiramente, fechando, assim, o cordão.

N. B. - Existem no mercado tricotins fabricados para reacções pós-coluna (SUPELCO).

(ver documento original)
CAPÍTULO XV
Hexaclorofeno - Identificação
A - Identificação
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método é aplicável a todos os produtos cosméticos.
2 - Princípio:
O hexaclorofeno contido na amostra é extraído pelo acetato de etilo e identificado por cromatografia em camada fina.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Solução de ácido sulfúrico 8 N.
3.2 - Celite AW.
3.3 - Acetato de etilo.
3.4 - Eluente: benzeno contendo 1% (v/v) de ácido acético glacial.
3.5 - Revelador n.º 1:
Solução de rodamina B: dissolver 100 mg de rodamina B numa mistura de 150 ml de óxido de dietilo, 70 ml de etanol absoluto e 16 ml de água.

3.6 - Revelador n.º 2:
Solução de 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclo-hexa-2,5-dienona: dissolver 400 mg de 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclo-hexa-2,5-dienona em 100 ml de metanol (a preparar diariamente).

Solução de carbonato de sódio: dissolver 10 g de carbonato de sódio em 100 ml de água desmineralizada.

3.7 - Solução padrão:
Solução de 0,05% (m/v) de hexaclorofeno em acetato de etilo (3.3).
4 - Aparelhagem:
4.1 - Placas para cromatografia em camada fina de sílica F(índice 254) de 20 cm x 20 cm.

4.2 - Material corrente de laboratório para cromatografia em camada fina.
4.3 - Banho termostatado para 26ºC.
5 - Preparação da amostra:
5.1 - Misturar cuidadosamente 1 g de amostra homogeneizada com 1 g de celite AW (3.2) e 1 ml de solução de ácido sulfúrico (3.1).

5.2 - Secar a 100ºC durante duas horas.
5.3 - Arrefecer e reduzir o resíduo seco a pó fino.
5.4 - Extrair duas vezes com 10 ml de acetato de etilo (3.3) de cada vez. Centrifugar após cada extracção e juntar as fases de acetato de etilo.

5.5 - Evaporar a 60ºC.
5.6 - Dissolver o resíduo em 2 ml de acetato de etilo (3.3).
6 - Técnica:
6.1 - Aplicar 2 (mi)l de solução da amostra 5.6 e 2 (mi)l de solução padrão (3.7) sobre uma placa (4.1).

6.2 - Saturar a tina termostatada a 26ºC com eluente (3.4).
6.3 - Colocar a placa de cromatografia em camada fina na tina e desenvolver até 15 cm.

6.4 - Retirar a placa e secar na estufa a 105ºC.
6.5 - Revelação:
Revelam-se as manchas de hexaclorofeno como indicado nos n.os 6.5.1 ou 6.5.2.
6.5.1 - Pulverizar o revelador n.º 1 (3.5) de modo uniforme sobre a placa. Passados trinta minutos, examinar a placa com luz UV de 254 nm.

6.5.2 - Pulverizar o revelador n.º 2 (3.6) utilizando sucessivamente a solução de 2,6-dibromo-4-(cloroimino) ciclo-hexa-2,5-dienona e em seguida a solução de carbonato de sódio. Examinar a placa à luz do dia após dez minutos de secagem à temperatura ambiente.

7 - Interpretação dos resultados:
7.1 - Revelador n.º 1 (3.5):
O hexaclorofeno é revelado sob forma de manchas azuladas sobre fundo amarelo-laranja, fluorescente e apresenta um Rf de 0,5, aproximadamente.

7.2 - Revelador n.º 2 (3.6):
O hexaclorofeno é revelado sob forma de manchas de azul-celeste a azul-turquesa sobre fundo branco e apresenta um Rf de 0,5, aproximadamente.

CAPÍTULO XVI
Hidróxidos de sódio e de potássio livres
Identificação e doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve o procedimento que permite identificar os produtos cosméticos contendo quantidades importantes de hidróxidos de sódio e ou de potássio livres e dosear estes hidróxidos nos produtos de desfrisagem dos cabelos e nos solventes da cutícula das unhas.

2 - Definição:
O hidróxido de sódio e de potássio livre define-se como sendo o volume de ácido de referência necessário para neutralizar o produto em condições determinadas e exprime-se sob a forma de hidróxido de sódio livre.

3 - Princípio:
A amostra é dissolvida ou dispersa em água e titulada com o ácido de referência. Regista-se a variação do valor do pH ao mesmo tempo que se acrescenta o ácido: para uma solução simples de hidróxidos de sódio ou potássio, o fim da titulação corresponde a uma variação precisa do valor do pH registado.

A curva de titulação normal pode ser modificada pela presença de:
a) Amónia e outras bases orgânicas fracas, que apresentam, elas próprias, uma curva de titulação bastante plana. Neste caso, a amónia é eliminada por evaporação sob pressão reduzida, à temperatura ambiente;

b) Sais de ácidos fracos, o que pode originar uma curva de titulação apresentando vários pontos de inflexão. Neste caso, só a primeira parte da curva, até ao primeiro destes pontos de inflexão, corresponde à neutralização do ião hidróxilo proveniente do hidróxido de sódio e de potássio livre.

Preconiza-se um outro procedimento de titulação, no álcool, quando é indicado que existe uma interferência excessiva dos sais de ácidos inorgânicos fracos. Se bem que seja teoricamente possível encontrar outras bases fortes solúveis, tais como hidróxido de lítio ou hidróxido de amónio quaternário, que dão um pH elevado, a sua presença neste tipo de produtos cosméticos é altamente improvável.

4 - Identificação:
4.1 - Reagentes:
4.1.1 - Solução tampão alcalina de referência de pH 9,18 a 25ºC: solução 0,05 M de tetraborato de sódio.

4.2 - Aparelhagem:
4.2.1 - Material corrente de laboratório.
4.2.2 - Potenciómetro.
4.2.3 - Eléctrodo de vidro.
4.2.4 - Eléctrodo de referência de calomelanos.
4.3 - Técnica:
Aferir o aparelho de medida por meio da solução tampão de referência (4.1.1). Preparar uma solução ou dispersão a 10% do produto a analisar em água e filtrar. Determinar o pH. Se for igual ou superior a 12, é necessário efectuar um doseamento.

5 - Doseamento:
5.1 - Titulação em meio aquoso:
5.1.1 - Reagentes:
5.1.1.1 - Solução 0,1 N de ácido clorídrico titulada.
5.1.2 - Aparelhagem:
5.1.2.1 - Material corrente de laboratório.
5.1.2.2 - Potenciómetro, de preferência com registador.
5.1.2.3 - Eléctrodo de vidro.
5.1.2.4 - Eléctrodo de referência de calomelanos.
5.1.3 - Técnica:
Pesar com precisão, num copo de 150 ml, uma tomada de ensaio de 0,5 g a 1 g. Na presença de amoníaco, juntar algumas bolas de vidro, colocar o copo num exsicador para vácuo, proceder ao vácuo até que o cheiro de amoníaco desapareça (cerca de três horas). Dissolver ou dispersar o resíduo em 100 ml de água. Titular com uma solução de ácido clorídrico 0,1 N (5.1.1.1), registando a variação do pH (5.1.2.2).

5.1.4 - Cálculos:
Determinar os pontos de inflexão da curva de titulação. Quando o primeiro ponto de inflexão aparece a um pH inferior a 7, a amostra não contém hidróxido de sódio ou de potássio. Quando se formam dois ou vários pontos de inflexão na curva, só o primeiro é tomado em consideração. Anotar o volume da solução de titulação neste primeiro ponto de inflexão.

Seja:
V = o volume da solução de titulação, em mililitros;
M = a massa da tomada de ensaio, em gramas.
A concentração em hidróxidos de sódio e, ou de potássio é expressa em percentagem (m/m) de hidróxido de sódio pela fórmula:

Percentagem de hidróxido de sódio = 0,4 V/M
Pode acontecer que, apesar da indicação da presença de uma quantidade bastante importante de hidróxidos de sódio e ou potássio, a curva de titulação não apresente ponto de inflexão distinto. Neste caso, convém proceder a um novo doseamento em isopropanol.

5.2 - Titulação em isopropanol:
5.2.1 - Reagentes:
5.2.1.1 - Isopropanol.
5.2.1.2 - Solução aquosa titulada 1,0 N de ácido clorídrico.
5.2.1.3 - A solução 0,1 N de ácido clorídrico no isopropanol é preparada imediatamente antes da utilização por diluição da solução aquosa de ácido clorídrico 1,0 N, com isopropanol.

5.2.2 - Aparelhagem:
5.2.2.1 - Material corrente de laboratório.
5.2.2.2 - Potenciómetro, de preferência com registador.
5.2.2.3 - Eléctrodo de vidro.
5.2.2.4 - Eléctrodo de referência de calomelanos.
5.2.3 - Técnica:
Pesar com precisão, num copo de 150 ml, uma tomada de ensaio entre 0,5 g e 1 g. Na presença de amoníaco, juntar algumas bolas de vidro, colocar o copo num exsicador para vácuo e proceder ao vácuo até que o cheiro de amoníaco desapareça (cerca de três horas). Dissolver ou dispersar o resíduo em 100 ml de isopropanol. Titular com a solução 0,1 N de ácido clorídrico no isopropanol (5.2.1.3) registando a variação do pH aparente (5.2.2.2).

5.2.4 - Cálculos:
O mesmo método que no n.º 5.1.4. O primeiro ponto de inflexão é visível a um pH aparente de cerca de 9.

5.3 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para teores da ordem dos 5% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,25%.

CAPÍTULO XVII
8-hidroxiquinoleína e seu sulfato
Identificação e dosamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve a identificação e o doseamento de 8-hidroxiquinoleína e do seu sulfato.

2 - Definição:
O teor da amostra em 8-hidroxiquinoleína determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de 8-hidroxiquinoleína.

3 - Princípio:
3.1 - Identificação:
É efectuada por cromatografia em camada fina.
3.2 - Doseamento:
É efectuado por espectrofotometria em 410 nm de um complexo de cobre obtido por reacção com o licor de Fehling.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - 8-hidroxiquinoleína.
4.2 - Benzeno (tendo em conta a toxicidade do produto, tomar as precauções adequadas).

4.3 - Clorofórmio.
4.4 - Solução de hidróxido de sódio a 50% (m/m).
4.5 - Sulfato de cobre (CuSO(índice 4) . 5 H(índice 2)O).
4.6 - Tartarato duplo de potássio e de sódio.
4.7 - Ácido clorídrico 1 N.
4.8 - Ácido sulfúrico 1 N.
4.9 - Solução de hidróxido de potássio 1 N.
4.10 - Etanol.
4.11 - 1-butanol.
4.12 - Ácido acético glacial.
4.13 - Ácido clorídrico 0,1 N.
4.14 - Celite 545, ou equivalente.
4.15 - Soluções padrão:
4.15.1 - Colocar 100 mg de 8-hidroxiquinoleína (4.1) num balão aferido de 100 ml e dissolver numa pequena quantidade de ácido sulfúrico 1 N (4.8). Completar o volume com ácido sulfúrico 1 N (4.8).

4.15.2 - Colocar 100 mg de 8-hidroxiquinoleína (4.1) num balão aferido de 100 ml. Dissolver no etanol (4.10). Completar o volume com o mesmo solvente e misturar.

4.16 - Licor de Fehling:
Solução A: num balão aferido de 100 ml pesar 7 g de sulfato de cobre (4.5). Dissolver numa pequena quantidade de água, completar o volume com água e misturar.

Solução B: num balão aferido de 100 ml pesar 35 g de tartarato duplo de potássio e de sódio (4.6) e dissolvê-los em 50 ml de água. Juntar 20 ml de hidróxido de sódio a 50% (4.4). Completar o volume com água e misturar.

Imediatamente antes da utilização, para um balão aferido de 100 ml, pipetar 10 ml de solução A e 10 ml de solução B. Completar o volume com água e misturar.

4.17 - Eluentes:
Eluente I: 1-butanol, ácido acético e água (80:20:20, em volume).
Eluente II: clorofórmio e ácido acético (95:5, em volume).
4.18 - Solução a 1% de 2,6-dicloro-4-(cloroimino) ciclo-hexa-2,5-dienona em etanol (4.10).

4.19 - Solução de carbonato de sódio a 1% (m/v).
4.20 - Solução a 30% (v/v) de etanol (4.10) em água.
4.21 - Solução de di-hidrogenoetilenodiaminatetra-acetato dissódico a 5% (m/v).

4.22 - Solução tampão de pH 7:
Pesar 27 g de KH(índice 2)PO(índice 4) e 70 g de K(índice 2)HPO(índice 4) . 3 H(índice 2)O num balão aferido de 1 l. Dissolver. Completar o volume e misturar.

4.23 - Placas para cromatografia em camada fina de sílica prontas para utilização, com a espessura de 0,25 mm (Kieselgel 60 Merck, ou equivalente). Antes da utilização, cada placa deve ser pulverizada com 10 ml do reagente 4.21 e seca a 80ºC.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Balões esmerilados de fundo redondo de 100 ml.
5.2 - Balões aferidos.
5.3 - Pipetas graduadas de 10 ml e 5 ml.
5.4 - Pipetas aferidas de 20 ml, 15 ml, 10 ml e 5 ml.
5.5 - Ampolas de decantação de 100 ml, 50 ml e 25 ml.
5.6 - Filtros de pregas de 9 cm de diâmetro.
5.7 - Evaporador rotativo.
5.8 - Refrigerante de refluxo esmerilado.
5.9 - Espectrofotómetro.
5.10 - Tinas de 1 cm de percurso óptico.
5.11 - Agitador com aquecimento.
5.12 - Coluna de vidro para cromatografia de 160 mm de altura e 8 mm de diâmetro, cuja parte inferior está munida de um estreitamento tapado por tampão de lã de vidro e cuja parte superior é adaptada à eluição sob pressão.

6 - Técnica:
6.1 - Identificação:
6.1.1 - Amostras líquidas:
6.1.1.1 - Depois de ter levado a 7 o pH de uma fracção de amostras a analisar, aplica-se 5 (mi)ml e 10 (mi)l em cada um dos pontos da linha de partida de uma placa recoberta de uma camada delgada de gele de sílica, tratada previamente como referido no n.º 4.23.

6.1.1.2 - Sobre dois outros pontos da linha de partida, aplicam-se 10 (mi)l e 30 (mi)l da solução padrão (4.15.2) e seguidamente desenvolve-se a placa com um dos dois eluentes (4.17).

6.1.1.3 - Quando o eluente atingiu 15 cm, a placa é seca a 110ºC durante quinze minutos. Com luz UV (366 nm), as manchas de 8-hidroxiquinoleína caracterizam-se por uma fluorescência amarela.

6.1.1.4 - A placa é seguidamente pulverizada com uma solução aquosa de carbonato de sódio a 1% (4.19) e, após a secagem, com uma solução a 1% de 2,6-dicloro-4-(cloroimino) ciclo-hexa-2,5-dienona (4.18). A 8-hidroxiquinoleína aparece na forma de uma mancha azul.

6.1.2 - Amostras sólidas e cremes:
6.1.2.1 - Colocar 1 g de amostra em suspensão em 5 ml da solução tampão de pH 7 (4.22). Transferir com 10 ml de clorofórmio para uma ampola de decantação e agitar. Depois de ter separado a camada clorofórmica, extrair por duas vezes a suspensão aquosa com 10 ml de clorofórmio (4.3). Misturar e filtrar os extractos clorofórmicos para um balão de fundo redondo de 100 ml (5.1). Concentrar até à secura quase total no evaporador rotativo. Retomar o resíduo em 2 ml de clorofórmio e aplicar 10 (mi)l e 30 (mi)l da solução obtida numa placa de gele de sílica, procedendo como foi indicado no n.º 6.1.1.1.

6.1.2.2 - Após ter aplicado 10 (mi)l e 30 (mi)l da solução padrão (4.15.2), procede-se como indicado nos n.os 6.1.1.2, 6.1.1.3 e 6.1.1.4.

6.2 - Doseamento:
6.2.1 - Amostras líquidas:
6.2.1.1 - Num balão esmerilado de fundo redondo de 100 ml pesar 5 g da amostra. Juntar 1 ml de ácido sulfúrico 1 N (4.8) e concentrar a mistura até à secura quase total, a pressão reduzida, a 50ºC.

6.2.1.2 - Dissolver este resíduo em 20 ml de água quente. Transferir para um balão aferido de 100 ml e lavar por três vezes com 20 ml de água. Completar 100 ml com água e misturar.

6.2.1.3 - Pipetar 5 ml desta solução para uma ampola de decantação de 50 ml (5.5). Depois de se juntar 10 ml de licor de Fehling (4.16), extrair o complexo de cobre formado por três vezes com 8 ml de clorofórmio (4.3).

6.2.1.4 - Juntar as fases clorofórmicas filtradas num balão aferido de 25 ml (5.2). Completar o volume com clorofórmio (4.3) e agitar. Determinar a densidade óptica da solução amarela a 410 nm em relação ao clorofórmio.

6.2.2 - Amostras sólidas e cremes:
6.2.2.1 - Num balão de fundo redondo de 100 ml (5.1) pesar 0,500 g da amostra. Juntar 30 ml de benzeno (4.2) e 20 ml de ácido clorídrico 1 N (4.7). Aquecer à ebulição com refluxo durante trinta minutos, agitando.

6.2.2.2 - Transferir o conteúdo do balão para uma ampola de decantação (5.5) de 100 ml e lavar com 5 ml de ácido clorídrico 1 N (4.7). Transferir a fase aquosa para um balão de fundo redondo (5.1). Lavar a fase benzénica com 5 ml de ácido clorídrico 1 N (4.7) e recolher as águas de lavagem no balão. Prosseguir como indicado no n.º 6.2.2.4.

6.2.2.3 - Caso das emulsões que não convêm para prosseguimento da análise. Misturar 0,500 g da amostra com 2 g de celite 545 (4.14), de modo a obter um pó fluido. Colocar a mistura, em pequenas fracções, na coluna de vidro para cromatografia (5.12). Após cada adição, homogeneizar e compactar o conteúdo da coluna. Quando toda a mistura amostra-celite for introduzida na coluna, eluir com ácido clorídrico 0,1 N (4.13), de modo a obter 10 ml de eluído em cerca de dez minutos. Em caso de necessidade, pode-se proceder a esta eluição, exercendo uma ligeira pressão com azoto. Durante a eluição é conveniente assegurar-se de que há sempre ácido clorídrico acima da mistura amostra-celite.

Os primeiros 10 ml de eluído são seguidamente tratados como indicado no n.º 6.2.2.4.

6.2.2.4 - As fases aquosas (6.2.2.2) ou os eluídos (6.2.2.3) são misturados e concentrados até à secura quase total, sob pressão reduzida, no evaporador rotativo.

6.2.2.5 - Dissolver o resíduo em 6 ml da solução de hidróxido de sódio 1 N (4.9). Juntar 20 ml de licor de Fehling (4.16) e transferir para uma ampola de decantação de 50 ml (5.5). Lavar o balão com 8 ml de clorofórmio (4.3) e transferir para ampola de decantação. Após agitação, a fase clorofórmica é filtrada e recolhida num balão aferido de 50 ml (5.2).

6.2.2.6 - A fase aquosa é extraída por três vezes com 8 ml de clorofórmio (4.3). As fases clorofórmicas são filtradas e recolhidas num balão aferido de 50 ml. Completar o volume com clorofórmio e agitar. Determinar a densidade óptica da solução amarela a 410 nm em relação ao clorofórmio.

7 - Curva de calibração:
7.1 - Para balões de fundo redondo de 100 ml (5.1), contendo cada um 3 ml de uma solução aquosa de etanol a 30% (4.20), pipetar 5 ml, 10 ml, 15 ml e 20 ml da solução padrão (4.15.1) e proceder como indicado no n.º 6.2.1.

8 - Expressão dos resultados:
8.1 - Amostras líquidas:
Percentagem (m/m) de 8-hidroxiquinoleína = a x 100/m
em que:
a = número de miligramas de 8-hidroxiquinoleína extrapolados na curva de calibração (7);

m (mg) = massa de amostra (6.2.2.1).
8.2 - Amostras sólidas e cremes:
Percentagem (m/m) de 8-hidroxiquinoleína = 2a x 100/m
em que:
a = número de miligramas de 8-hidroxiquinoleína extrapolados na curva de calibração (7);

m (mg) = massa de amostra (6.2.2.1).
9 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em 8-hidroxiquinoleína da ordem de 0,3%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,02%.

CAPÍTULO XVIII
Iodato de sódio - Identificação e doseamento
Objectivo e campo de aplicação:
O método é adequado para a identificação e doseamento do iodato de sódio nos produtos cosméticos sujeitos a lavagem após utilização.

A - Identificação
1 - Princípio:
O iodato de sódio é separado dos outros halogenatos por cromatografia em camada fina e identificado por oxidação do iodeto em iodo.

2 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
2.1 - Soluções de referência: soluções aquosas de clorato, bromato e iodato de potássio a 0,01% (m/v) preparadas recentemente.

2.2 - Eluente: solução de amoníaco a 28% (m/v), acetona e butanol (60:130:30, em volume).

2.3 - Solução aquosa de iodeto de potásio a 5% (m/v).
2.4 - Solução de amido de 1% a 5% (m/v).
2.5 - Ácido clorídrico 1 M.
3 - Aparelhagem:
3.1 - Placas de cromatografia em camada fina prontas para utilização, revestidas de celulose (0,25 mm).

3.2 - Material corrente de cromatografia em camada fina.
4 - Técnica:
4.1 - Extrair cerca de 1 g de amostra com água, filtrar e diluir a cerca de 10 ml.

4.2 - Aplicar 2 (mi)l desta solução na linha de base da placa (3.1) e 2 (mi)l de cada uma das três soluções de referência (2.1).

4.3 - Colocar a placa numa tina de desenvolvimento e desenvolver por cromatografia ascendente aproximadamente no percurso de três quartos do comprimento da placa com a ajuda do eluente (2.2).

4.4 - Retirar a placa da tina e deixar evaporar o eluente à temperatura ambiente.

Nota. - A operação pode demorar duas horas.
4.5 - Pulverizar a placa com iodeto de potássio (2.3) e deixar secar durante cerca de cinco minutos.

4.6 - Pulverizar seguidamente com a solução de amido (2.4) e deixar secar durante cerca de cinco minutos.

4.7 - Pulverizar finalmente com ácido clorídrico (2.5).
5 - Avaliação:
Em presença de iodato, aparece imediatamente uma mancha azul, tornando-se acastanhada, com o valor de Rf aproximadamente de 0 a 0,2. Os bromatos reagem imediatamente, apresentando valores de Rf de 0,5 a 0,6, e os cloratos reagem cerca de trinta minutos depois, apresentando valores de Rf de 0,7 a 0,8.

B - Doseamento
1 - Definição:
O teor da amostra em iodato de sódio determinado por este método é expresso em percentagem da massa de iodato de sódio.

2 - Princípio:
O iodato de sódio é dissolvido em água e doseado por cromatografia líquida a alta pressão, utilizando (em série) uma coluna de fase reversa C 18 e uma coluna permutadora de aniões.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. Devem, nomeadamente, ser apropriados para a cromatografia líquida a alta pressão.

3.1 - Ácido clorídrico 4 M.
3.2 - Solução aquosa de sulfito de sódio a 5% (m/v).
3.3 - Solução mãe de iodato de sódio: preparar uma solução contendo 50 mg de iodato de sódio por 100 ml de água.

3.4 - Di-hidrogeno-ortofosfato de potássio.
3.5 - Hidrogeno-ortofosfato dissódico 2H(índice 2)O.
3.6 - Fase móvel da cromatografia líquida a alta pressão: dissolver 3,88 g de di-hidrogeno-ortofosfato de potássio (3.4) e 1,19 g de hidrogeno-ortofosfato dissódico 2H(índice 2)O (3.5) em 1 l de água.

O pH da solução obtida é 6,2.
3.7 - Papel indicador universal, pH 1-11.
4 - Aparelhagem:
Material corrente de laboratório.
4.1 - Papel de filtro de 110 mm de diâmetro, Schleicher e Schull n.º 5/5, ou equivalente.

4.2 - Cromatógrafo líquido a alta pressão munido de um detector com comprimento de onda variável.

4.3 - Colunas: com comprimento de 120 mm e com diâmetro interno de 4,6 mm, em número de dois, em série; primeira coluna com nucleosil (R) 5 C 18, ou equivalente, segunda coluna com Vydac, TM-301-SB, ou equivalente.

5 - Técnica:
5.1 - Preparação das amostras:
5.1.1 - Amostras fluidas (champôs):
Pesar com precisão uma tomada de ensaio de cerca de 1,0 g em proveta graduada com rolha esmerilada ou num balão aferido de 10 ml. Completar com água e misturar. Em caso de necessidade, filtrar a solução. Determinar a quantidade de iodato na solução por meio de cromatografia líquida a alta pressão, conforme é descrito no n.º 5.2.

5.1.2 - Amostras sólidas (sabão):
Dividir finamente uma parte da amostra, pesar com precisão uma tomada de ensaio de cerca de 1,0 g e introduzir em proveta graduada com rolha esmerilada de 100 ml. Encher com água até 50 ml e agitar energicamente durante um minuto; centrifugar ou filtrar por papel, ou deixar repousar a mistura durante uma noite, pelo menos; agitar energicamente a solução gelatinosa e filtrar esta por papel (4.1). Dosear o iodato no filtrado por cromatografia líquida a alta pressão, conforme é descrito no n.º 5.2.

5.2 - Cromatografia:
Débito: 1 ml/min.;
Comprimento de onda do detector: 210 nm;
Volume injectado: 10 (mi)l;
Medida: área do pico.
5.3 - Calibração:
Pipetar, respectivamente, 1,0 ml, 2,0 ml, 5,0 ml, 10,0 ml e 20,0 ml da solução mãe do iodato de sódio (3.3) em balões aferidos de 50 ml. Completar o volume e agitar. As soluções assim obtidas contêm, respectivamente, 0,01 mg, 0,02 mg, 0,05 mg, 0,10 mg e 0,20 mg de iodato de sódio por mililitro. Injectar 10 (mi)l de cada solução de referência no cromatógrafo líquido (4.2). Determinar a área do pico para o iodato e estabelecer uma curva de calibração: área do pico-concentração de iodato.

6 - Cálculo:
Calcular o teor de iodato de sódio em percentagem de massa (% m/m) utilizando a fórmula:

Percentagem de massa de iodato de sódio = Vc/10 m
em que:
m = a massa, expressa em gramas, da tomada de ensaio (5.1);
V = o volume total da solução de amostra, expresso em mililitros, obtido conforme é descrito no n.º 5.1;

c = a concentração, expressa em miligramas/mililitros, de iodato de sódio obtido a partir da curva de calibração.

7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em iodato de sódio de 0,1% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos efectuados em paralelo na mesma amostra não deve ultrapassar 0,002%.

8 - Confirmação:
8.1 - Princípio:
Em solução ácida, o iodato (ver documento original) é reduzido a iodeto (ver documento original) pelo sulfito e a solução obtida é examinada por cromatografia líquida a alta pressão. Se um pico com um iodato desaparecer após tratamento com sulfito, o pico original pode ser considerado como o iodato.

8.2 - Técnica:
Pipetar para matrás uma tomada de ensaio de 5 ml da solução da amostra obtida no n.º 5.1. Ajustar o pH da solução a um valor inferior ou igual a 3 com ácido colorídrico (3.1) e papel indicador universal de pH (3.7). Juntar três gotas da solução de sulfito sódico (3.2) e agitar. Injectar 10 (mi)l da solução no cromatógrafo líquido (4.2). Comparar o cromatograma com o que foi obtido da forma descrita no n.º 5 para a mesma amostra.

CAPÍTULO XIX
Metanol em relação ao etanol ou ao 2-propanol - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento do metanol por cromatografia em fase gasosa em todos os tipos de produtos cosméticos, incluindo os aerossóis. Aplica-se a concentrações relativas de 0% a 10%.

2 - Definição:
O teor em metanol determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de metanol em relação com a massa de etanol ou de 2-propanol.

3 - Princípio:
O doseamento é efectuado por cromatografia em fase gasosa.
4 - Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Metanol.
4.2 - Etanol absoluto.
4.3 - 2-propanol.
4.4 - Clorofórmio, lavado com água para eliminar os álcoois.
5 - Aparelhagem:
5.1 - Cromatógrafo de fase gasosa com detector catarométrico (para as amostras de produtos em aerossóis). Cromatógrafo de fase gasosa com detector de ionização de chama (para as amostras de outros produtos).

5.2 - Balões aferidos de 100 ml.
5.3 - Pipetas aferidas de 0,1 ml, 2 ml e 20 ml.
5.4 - Microsseringas de 0 (mi)l a 100 (mi)l e de 0 (mi)l a 5 (mi)l:
Somente para as amostras de produtos em aerossóis, seringa especial para gás, com válvula móvel (figura 5 do método de amostragem).

6 - Técnica:
6.1 - Preparação das amostras:
6.1.1 - Os produtos em aerossóis são tratados como indicado na 2.ª parte e depois analisados por cromatografia em fase gasosa nas condições indicadas no n.º 6.2.

6.1.2 - Os outros produtos, tratados como indicado na 2.ª parte, são diluídos em água até uma concentração de 1% a 2% de etanol ou de 2-propanol, e depois analisados por cromatografia em fase gasosa nas condições indicadas no n.º 6.2.2.

6.2 - Condições de cromatografia em fase gasosa:
6.2.1 - Para as amostras de produtos em aerossóis:
6.2.1.1 - Utilizar-se-á uma coluna cheia com 10% de Hallcomid M 18 sobre Chromosorb WAW 100-120 mesh e um detector catarométrico.

6.2.1.2 - A fase estacionária deve permitir um grau de resolução igual ou superior a 1,5:

R = 2 x (d'R(índice 2) - d'R(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
em que:
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos, de dois picos;

W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos mesmos picos a meia altura;
d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
6.2.1.3 - As condições seguintes permitem obter bons resultados:
Tipo de coluna: aço inoxidável;
Comprimento: 3,5 m;
Diâmetro: 3 mm;
Intensidade de corrente do detector catarométrico: 150 mA;
Gás de arrastamento: hélio:
Pressão: 2,5 b;
Débito: 45 ml/min.;
Temperaturas:
Injector: 150ºC;
Detector: 150ºC;
Coluna: 65ºC.
6.2.2 - Para as amostras de outros produtos:
6.2.2.1 - Utilizar-se-á uma coluna cheia com Chromosorb 105 ou com Porapak Qs e um detector de ionização de chama.

6.2.2.2 - A fase estacionária deve permitir um grau de resolução igual ou superior a 1,5:

(ver documento original)
6.2.2.3 - As condições seguintes permitem obter bons resultados:
Tipo de coluna: aço inoxidável;
Comprimento: 2 m;
Diâmetro: 3 mm;
Electrómetro: sensibilidade de 8.10(elevado a -10) A;
Gás de arrastamento: azoto:
Pressão: 2,1 b;
Débito: 40 ml/min.;
Auxiliar: hidrogénio:
Pressão: 1,5 b;
Débito: 20 ml/min.;
Temperaturas:
Injector: 150ºC;
Detector: 230ºC;
Colunas: 120ºC ou 130ºC.
7 - Curvas padrão:
7.1 - Nas condições indicadas no n.º 6.2.1 (coluna Hallcomid M 18), utilizar as misturas padrão definidas seguidamente. Preparar estas misturas por medida volumétrica, mas determinar a quantidade exacta libertada, pesando imediatamente após cada adição:

(ver documento original)
Injectar 2 (mi)l a 3 (mi)l no cromatógrafo, como foi indicado no n.º 6.2.1. Calcular a razão das áreas dos picos (metanol/etanol ou metanol/2-propanol) de cada mistura. Traçar a curva padrão utilizando:

Como eixo dos X: a percentagem de metanol em relação ao etanol ou ao 2-propanol;

Como eixo dos Y: a razão das áreas dos picos (metanol/etanol ou metanol/2-propanol).

7.2 - Nas condições indicadas no n.º 6.2.2 (Porapak Qs ou Chromosorb 105), utilizar as misturas padrão definidas seguidamente. Preparar estas misturas por medida volumétrica, mas determinar a quantidade exacta libertada, pesando imediatamente após cada adição:

(ver documento original)
Injectar 2 (mi)l a 3 (mi)l no cromatógrafo, como foi indicado no n.º 6.2.2. Calcular a razão das áreas dos picos (metanol/etanol ou metanol/2-propanol) de cada mistura. Traçar a curva padrão utilizando:

Como eixo dos X: a percentagem de metanol em relação ao etanol ou ao 2-propanol;

Como eixo dos Y: a razão das áreas dos picos (metanol/etanol ou metanol/2-propanol).

7.3 - Nos dois casos a curva de calibração deve ser uma recta.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para teores em metanol de 5% em relação ao etanol ou ao 2-propanol, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,25%.

CAPÍTULO XX
Nitritos - Identificação e doseamento
A - Identificação
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método destina-se à identificação dos nitritos nos produtos cosméticos. Aplica-se, em particular, aos cremes, aos produtos pastosos e aos dentifrícios.

2 - Princípio:
A caracterização dos nitritos faz-se com fenil-hidrazona-2-aminobenzaldeído.
3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Ácido sulfúrico diluído: diluir 2 ml de ácido sulfúrico concentrado (d(elevado 20)(índice 4)) em 11 ml de água destilada.

3.2 - Ácido clorídrico diluído: diluir 1 ml de ácido clorídrico concentrado (d(elevado 20)(índice 4)) em 11 ml de água destilada.

3.3 - Metanol.
3.4 - Solução de fenil-hidrazona-2-aminobenzaldeído (reagente Nitrine R) em metanol.

Pesar 2 g de Nitrine R e introduzi-los em balão aferido de 100 ml. Juntar, gota a gota, 4 ml de ácido clorídrico diluído (3.2) e agitar. Completar o volume com metanol e misturar até que a solução esteja completamente límpida. Conservar a solução num frasco de vidro castanho (4.3).

4 - Material:
4.1 - Copos de 50 ml.
4.2 - Balão aferido de 100 ml.
4.3 - Frasco de vidro castanho de 125 ml.
4.4 - Placa de vidro de 10 cm x 10 cm.
4.5 - Espátula de material sintético.
4.6 - Papel de filtro de 10 cm x 10 cm.
5 - Técnica:
5.1 - Estender uniformemente uma parte da amostra a examinar sobre a placa de vidro (4.4), procurando que a espessura da camada não ultrapasse 1 cm.

5.2 - Mergulhar uma folha de papel de filtro (4.6) em água destilada e colocá-la sobre a amostra, aplicando-a convenientemente com a ajuda da espátula (4.5).

5.3 - Esperar cerca de um minuto e colocar no meio do papel de filtro:
Duas gotas de ácido sulfúrico diluído (3.1); e seguidamente
Duas gotas da solução de Nitrine R (3.4).
5.4 - Passados cinco a dez segundos, retirar o papel de filtro e examiná-lo à luz do dia. Uma coloração vermelho-violeta indica a presença de nitritos. Quando o teor em nitritos é pouco elevado, a coloração violeta passa para amarela em cinco a quinze segundos. Esta viragem não se verifica senão passados um a dois minutos em presença de quantidades significativas de nitritos.

6 - Nota. - A intensidade da coloração violeta, bem como a duração da passagem para o amarelo, pode dar uma indicação do teor em nitritos da amostra.

B - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método indicado seguidamente é adaptado ao doseamento dos nitritos nos produtos cosméticos.

2 - Definição:
O teor da amostra em nitritos determinado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de nitrito de sódio.

3 - Princípio:
Após diluição e clarificação da amostra, efectua-se uma reacção colorimétrica com a N-((alfa)-naftilo-etilenodiamina) e a intensidade da coloração obtida é determinada a 538 nm.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Reagentes de clarificação (estes reagentes não podem ser utilizados mais de uma semana após a sua preparação):

4.1.1 - Reagente I (Carrez I):
Dissolver 106 g de ferrocianeto de potássio K(índice 4)Fe(CN)(índice 6) . 3H(índice 2)O em água destilada e completar a 1000 ml.

4.1.2 - Reagente II (Carrez II):
Dissolver 219,5 g de acetato de zinco Zn(CH(índice 3)COO)(índice 2) . 2H(índice 2)O e 30 ml de ácido acético glacial em água destilada e completar a 1000 ml.

4.2 - Solução de nitrito de sódio:
Num balão aferido de 1000 ml dissolver 0,500 g de nitrito de sódio em água destilada e completar o volume. Diluir 10,0 ml desta solução mãe a 500 ml. 1 ml desta última solução = 10 (pi)g de NaNO(índice 2).

4.3 - Solução de hidróxido de sódio 1 N.
4.4 - Solução a 0,2% de cloridrato de sulfanilamida:
Dissolver 2 g de sulfanilamida em 800 ml de água quente. Arrefecer e juntar 100 ml de HCl concentrado, agitando. Completar a 1000 ml.

4.5 - Ácido clorídrico 5 N.
4.6 - Reagente de N-((alfa)-naftilo):
Dissolver 0,1 g de dicloridrato de N-((alfa)-naftilo-etilenodiamina) em água e completar a 100 ml. É preparado no próprio dia de utilização.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Balança analítica.
5.2 - Balões aferidos de 100 ml, 250 ml, 500 ml e 1000 ml.
5.3 - Pipetas aferidas.
5.4 - Provetas de 100 ml.
5.5 - Filtro de pregas isento de nitritos, de 15 cm de diâmetro.
5.6 - Banho-maria.
5.7 - Espectrofotómetro com tinas de 1 cm de percurso óptico.
5.8 - Potenciómetro.
5.9 - Microbureta de 10 ml.
5.10 - Copo de 50 ml.
6 - Técnica:
6.1 - Pesar, com uma precisão de cerca de 0,1 mg, cerca de 0,5 g (m) de amostra homogeneizada e introduzi-los num copo de 250 ml. Diluir até um volume de cerca de 150 ml com água destilada quente. Colocar o copo, durante meia hora, num banho-maria a 80ºC, agitando de vez em quando.

6.2 - Arrefecer à temperatura ambiente e juntar sucessivamente, agitando sempre, 2 ml do reagente de Carrez I (4.1.1) e 2 ml do reagente de Carrez II (4.1.2).

6.3 - Ajustar o pH a 8,3 no potenciómetro com uma solução de hidróxido de sódio 1 N. Transferir quantitativamente para um balão aferido de 250 ml e completar o volume com água destilada.

6.4 - Misturar e filtrar por filtro de pregas (5.5).
6.5 - Pipetar uma quantidade conveniente (V ml) do filtrado límpido, não ultrapassando 25 ml, para um balão aferido de 100 ml e diluir com água destilada até 60 ml.

6.6 - Misturar, adicionar 10,0 ml de cloridrato de sulfanilamida (4.4) e depois 6,0 ml de ácido clorídrico 5 N (4.5). Misturar e deixar repousar durante cinco minutos. Juntar 2,0 ml do reagente N-((alfa)-naftilo) (4.6), misturar e deixar repousar durante três minutos. Completar a 100 ml e misturar.

6.7 - Preparar um ensaio em branco, repetindo as operações efectuadas nos n.os 6.5 e 6.6 sem adição do reagente N-((alfa)-naftilo) (4.6).

6.8 - Determinar (5.7) a densidade óptica a 538 nm da solução da amostra (6.6) em relação à solução correspondente ao ensaio em branco (6.7).

6.9 - Ler na curva de calibração (6.10) o teor em nitrito de sódio, em microgramas por 100 ml de solução (m(índice 1)), correspondente à densidade óptica determinada para a amostra (6.8).

6.10 - Curva de calibração. Preparar com a solução de nitrito de sódio (4.2) uma curva de calibração na gama de 0 (mi)g-20 (mi)g-40 (mi)g-60 (mi)g-

-80 (mi)g-100 (mi)g de nitrito de sódio por 100 ml.
7 - Cálculo:
Calcular o teor da amostra em nitrito de sódio, em percentagem de massa (m/m), pela fórmula seguinte:

Percentagem de massa (m/m), de nitrito de sódio = 250/V x m(índice 1) x 10(elevado -6) x 100/m = m(índice 1)/V x m x 40

em que:
m = massa, em gramas, da amostra submetida a análise (6.1);
m(índice 1) = teor de nitrito de sódio em microgramas, determinado segundo as indicações do n.º 6.9;

V = mililitros de filtrado utilizados no n.º 6.5.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor de nitrito de sódio de 0,2%, a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,005%.

CAPÍTULO XXI
Nitrometano - Identificação e doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método é aplicável à identificação e ao doseamento do nitrometano nos produtos cosméticos acondicionados sob forma de aerossol, para uma concentração inferior ou igual a 0,3%.

2 - Definição:
O teor da amostra em nitrometano determinado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de nitrometano na totalidade do conteúdo de aerossol.

3 - Princípio:
O nitrometano é identificado por reacção corada. O seu doseamento é efectuado por cromatografia em fase gasosa, após adição de um padrão interno.

4 - Identificação:
4.1 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1.1 - Solução de hidróxido de sódio 0,5 N.
4.1.2 - Reagente de Folin:
Dissolver em água 0,1 g de sal sódico do ácido 1,2-naftoquinona-4-sulfónico e completar a 100 ml.

4.2 - Técnica:
Juntar 10 ml da solução do n.º 4.1.1 e 1 ml do reagente do n.º 4.1.2 a 1 ml de amostra. Uma coloração violeta indica a presença de nitrometano.

5 - Doseamento:
5.1 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
5.1.1 - Clorofórmio (padrão interno 1).
5.1.2 - 2,4-dimetil-heptano (padrão interno 2).
5.1.3 - Etanol a 95%.
5.1.4 - Nitrometano.
5.1.5 - Solução padrão em clorofórmio:
Num balão aferido de 25 ml previamente tarado introduzir cerca de 650 mg de clorofórmio (5.1.1). Pesar de novo com cuidado o balão e o seu conteúdo. Completar o volume com etanol a 95% (5.1.3). Pesar e calcular a percentagem em massa de clorofórmio nesta solução.

5.1.6 - Solução padrão com dimetil-heptano:
Proceder como para a solução padrão em clorofórmio, mas introduzir 270 mg de 2,4-dimetil-heptano (5.1.2) num balão aferido de 25 ml.

5.2 - Aparelhagem:
5.2.1 - Cromatógrafo de fase gasosa, com detector de ionização de chama.
5.2.2 - Aparelhagem para a amostragem dos aerossóis (frasco de transferência, microsseringa, ligação, etc.), tal como é descrita na 2.ª parte.

5.2.3 - Material corrente de laboratório.
5.3 - Técnica:
5.3.1 - Preparação da amostra:
Num frasco de transferência de 100 ml previamente tarado e liberto de ar (segundo a técnica descrita no n.º 5.4 da 2.ª parte) no qual se fez vácuo introduzir cerca de 5 ml de um ou outro dos padrões internos 5.1.5 ou 5.1.6. Utilizar uma seringa de vidro de 10 ml ou 20 ml sem agulha, adaptada ao dispositivo de recolha, segundo a técnica descrita no n.º 5 da 2.ª parte. Segundo a mesma técnica, introduzir no frasco cerca de 50 g do conteúdo da amostra de aerossol. Pesar de novo, a fim de determinar a quantidade da amostra introduzida. Misturar cuidadosamente. Injectar cerca de 10 ml, utilizando a microsseringa (5.2.2). Efectuar cinco injecções.

5.3.2 - Preparação do padrão:
Num balão aferido de 50 ml pesar com precisão cerca de 500 mg de nitrometano (5.1.4) em 500 mg de clorofórmio (5.1.1) ou 210 mg de 2,4-dimetil-heptano (5.1.2). Completar o volume com etanol a 95% (5.1.3). Misturar cuidadosamente. Introduzir 5 ml desta solução num balão aferido de 20 ml e completar o volume com etanol a 95% (5.1.3). Injectar cerca de 10 ml, utilizando a microsseringa (5.2.2). Efectuar cinco injecções.

5.3.3 - Condições de cromatografia em fase gasosa:
5.3.3.1 - Coluna:
Trata-se de uma coluna constituída por duas partes, a primeira contendo dodecilftalato em Gaschrome Q, como fase estacionária, a segunda Ucon 50 HB 280 X em Gaschrome Q, como fase estacionária. A coluna dupla assim preparada deve dar uma resolução R igual ou superior a 1,5, partindo do princípio de que:

R = 2 x (d'r(índice 2) - d'r(índice 1))/W(índice 1) + W(índice 2)
em que:
r(índice 1) e r(índice 2) = tempo de retenção, em minutos;
W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos picos a meia altura, em milímetros;
d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
A título de exemplo, são dadas as seguintes condições:
Parte A:
Coluna: aço inoxidável;
Comprimento: 1,5 m;
Diâmetro: 3 mm;
Enchimento: 20% de dodecilftalato em Gaschrome Q 100-120 mesh;
Parte B:
Coluna: aço inoxidável;
Comprimento: 1,5 m;
Diâmetro: 3 mm;
Enchimento: 20% de Ucon 50 HB 280 X em Gaschrome Q 100-120 mesh.
5.3.3.2 - Detector:
Ionização de chama. O electrómetro do detector deve ser regulado para uma sensibilidade de 8 x 10(elevado a -10)A.

5.3.3.3 - Temperaturas:
Injector: 150ºC;
Detector: 150ºC;
Coluna: entre 50ºC e 80ºC, segundo o tipo de coluna e a aparelhagem.
5.3.3.4 - Gás:
Gás de arrastamento: azoto;
Pressão: 2,1 b;
Débito: 40 ml/min.;
Detector: gás recomendado pelo fabricante.
6 - Cálculos:
6.1 - Factor de resposta do nitrometano, calculado em referência ao padrão interno utilizado.

Se n representa o nitrometano:
k(índice n) = o factor de resposta;
m'(índice n) = a sua massa, em gramas, na mistura;
S'(índice n) = a área do seu pico;
e se C representa o padrão interno, clorofórmio ou 2,4-dimetil-heptano:
m'(índice c) = a sua massa, em gramas, na mistura;
S'(índice c) = a área do seu pico.
A fórmula será:
k(índice n) = m'(índice n)/m'(índice c) x S'(índice c)/S'(índice n)
k(índice n) depende da parelhagem.
6.2 - Concentração do nitrometano na amostra:
Se n representa o nitrometano:
k(índice n) = o factor de resposta;
S(índice n) = a área do seu pico;
e se C representa o padrão interno, clorofórmio ou 2,4-dimetil-heptano:
m(índice c) = a massa, em gramas, na mistura;
S(índice c) = a área do seu pico;
e se c representa o padrão interno, clorofórmio ou 2,4-dimetil-heptano:
m(índice c) = a massa, em gramas, na mistura;
S(índice c) = a área do seu pico;
M(índice c) = a massa, em gramas, da amostra de aerossol transferida.
A percentagem (m/m) de nitrometano na amostra será igual a:
m(índice cn)/M x k(índice n) x S(índice n)/S(índice c) x 100
7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em nitrometano da ordem de 0,3% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,03%.

CAPÍTULO XXII
Quinina - Identificação e doseamento
A - Identificação
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método é destinado a pôr em evidência a presença de quinina nos champôs e loções capilares.

2 - Princípio:
A identificação efectua-se por cromatografia em camada fina de gele de sílica e é revelado pela fluorescência azul da quinina em meio ácido a 360 nm. Para posterior confirmação, pode-se anular esta fluorescência por meio de vapores de bromo e fazer segunda revelação pelos vapores de amoníaco, fazendo aparecer uma fluorescência amarelada.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Placas de gele de sílica com espessura de 0,25 mm sem indicador de fluorescência, formato 20 cm x 20 cm.

3.2 - Eluente: tolueno, éter, diclorometano e dietilamina (20:20:20:8, em volume).

3.3 - Metanol.
3.4 - Ácido sulfúrico a 96% (d(elevado 20)(índice 4) = 1,84).
3.5 - Éter:
3.6 - Revelador: juntar cuidadosamente 5 ml de ácido sulfúrico (3.4) a 95 ml de éter (3.5) num recipiente refrigerado.

3.7 - Bromo.
3.8 - Amónia a 28% (d(elevado 20)(índice 4) = 0,90).
3.9 - Quinina anidra.
3.10 - Solução padrão: pesar com precisão cerca de 100 mg de quinina anidra (3.9) e dissolvê-los em metanol (3.3) num balão aferido de 100 ml.

4 - Aparelhagem:
4.1 - Equipamento corrente de cromatografia em camada fina.
4.2 - Banho de ultra-sons.
4.3 - Filtros Millipore FH 0,5 (mi)m, ou equivalente, com aparelhagem de filtração adequada.

5 - Técnica:
5.1 - Preparação da amostra:
Pesar com precisão uma quantidade de produto cosmético susceptível de conter cerca de 100 mg de quinina. Introduzi-la num balão aferido de 100 ml, dissolver e completar o volume com metanol (3.3). Tapar e deixar durante uma hora à temperatura ambiente no banho de ultra-sons (4.2). Filtrar por membrana (4.3) e utilizar este filtrado para a cromatografia.

5.2 - Cromatografia em camada fina.
Aplicar sobre a placa de gele de sílica (3.1) 1,0 (mi)l de solução padrão (3.10) e 1,0 (mi)l de solução da amostra 5.1. Desenvolver o cromatograma no percurso de 15 cm, numa tina previamente saturada pelos vapores do eluente (3.2).

5.3 - Revelação:
5.3.1 - Secar a placa à temperatura ambiente.
5.3.2 - Pulverizar com reagente (3.6).
5.3.3 - Deixar secar a placa durante uma hora à temperatura ambiente.
5.3.4 - Observar a placa sob radiação ultravioleta a 360 nm. A quinina aparece sob a forma de uma mancha fluorescente azul intensa. A título de exemplo, o quadro seguinte reproduz os valores de Rf dos principais alcalóides da quina, usando o mesmo eluente (3.2):

(ver documento original)
5.3.5 - Para posterior confirmação da identificação da quinina, expõe-se durante cerca de uma hora a placa aos vapores de bromo (3.7); a fluorescência desaparece. Expondo seguidamente a mesma placa aos vapores de amoníaco (3.8), as manchas reaparecem com uma coloração castanha e, observando a placa sob raios ultravioletas a 360 nm, constata-se uma fluorescência amarelada. Limite de identificação: 0,1 (mi)g de quinina.

B - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento da quinina nos champôs e nas loções capilares. É o adequado para dosear, no máximo, 0,5% (m/m) nos champôs e 0,2% (m/m) nas loções.

2 - Definição:
O teor em quinina avaliado por este método é expresso em percentagem de massa (m/m) do produto.

3 - Princípio:
Após tratamento adequado do produto a analisar, o doseamento é efectuado por cromatografia líquida a alta pressão (HPLC).

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica. Devem, nomeadamente, ser adequados para a cromatografia líquida a alta pressão.

4.1 - Acetonitrilo.
4.2 - Di-hidrogeno-ortofosfato de potássio KH(índice 2)PO(índice 4).
4.3 - Ácido ortofosfórico a 85% (d(elevado 20)(índice 4) = 1,7).
4.4 - Brometo de tetrametilamónio.
4.5 - Quinina anidra.
4.6 - Metanol.
4.7 - Solução de ácido ortofosfórico 0,1 M: dissolver 11,53 g de ácido ortofosfórico (4.3) em 1000 ml de água destilada num balão aferido.

4.8 - Solução de di-hidrogeno-ortofosfato de potássio 0,1 M: dissolver 13,6 g de di-hidrogeno-ortofosfato de potássio (4.2) em 1000 ml de água destilada num balão aferido.

4.9 - Solução de brometo de tetrametilamónio 0,1 M: dissolver 15,40 g de brometo de tetrametilamónio (4.4) em 1000 ml de água destilada num balão aferido.

4.10 - Eluente: ácido ortofosfórico 0,1 M (4.7), di-hidrogeno-ortofosfato de potássio 0,1 M (4.8), brometo de tetrametilamónio 0,1 M (4.9), água para HPLC e acetonitrilo (4.1) (10:50:100:340:90, em volume).

A composição da fase móvel pode ser modificada de tal maneira que o factor de resolução R seja igual ou superior a 1,5:

R = 2 x (d'R(índice 2) - d'R(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
em que:
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos, de dois picos consecutivos;

W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos picos a meia altura, expressa em milímetros;

d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
4.11 - Sílica octadecilsilanisada de granulometria 10 (mi)m.
4.12 - Soluções padrão: numa série de balões aferidos de 100 ml, pesar sucessivamente, com precisão, 5,0 mg, 10,0 mg, 15,0 mg e 20,0 mg de quinina anidra (4.5). Completar o volume com metanol (4.6) e agitar até dissolução. Filtrar cada solução por filtro (5.5) de 0,5 (mi)m.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Banho de ultra-sons.
5.3 - Cromatógrafo em fase líquida a alta pressão com detector de ultravioleta com comprimento de onda variável.

5.4 - Coluna em ácido inoxidável: comprimento: 25 cm; diâmetro interior: 4,6 mm; enchimento: sílica octadecilsilanisada (4.11).

5.5 - Filtro Millipore FH 0,5 (mi)m, ou equivalente, com dispositivo de filtração apropriado.

6 - Técnica:
6.1 - Preparação da amostra:
Pesar com precisão num balão aferido de 100 ml uma quantidade de amostra correspondente a cerca de 10 mg de quinina anidra. Juntar 20 ml de metanol (4.6) e colocar o balão durante vinte minutos num banho de ultra-sons (5.2). Completar o volume com metanol (4.6). Homogeneizar a solução e filtrar uma parte alíquota por membrana (5.5).

6.2 - Condições da cromatografia:
Débito da fase móvel (4.10): 1,0 ml/min.;
Detecção: 332 nm;
Quantidade a injectar: 10,0 (mi)l da solução filtrada (6.1);
Medição da área do pico.
6.3 - Curva de calibração:
Introduzir pelo menos três vezes 10,0 (mi)l de cada uma das soluções padrão (4.12). Medir a área do pico e calcular o seu valor médio para cada concentração. Traçar a curva de calibração.

7 - Cálculo:
7.1 - A partir da curva de calibração (6.3), calcular a quantidade de quinina anidra, expressa em microgramas, contida no volume injectado.

7.2 - A concentração em quinina anidra na amostra, em percentagem de massa, é obtida pela fórmula seguinte:

Percentagem (m/m) de quinina anidra = B/A
em que:
B = quantidade, em microgramas, de quinina anidra contida em 10 (mi)l da solução filtrada (6.1);

A = massa da amostra 6.1, expressa em gramas.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em quinina anidra da ordem de 0,5% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ser superior a 0,02%.

Para um teor em quinina anidra da ordem de 0,2% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ser superior a 0,01%.

CAPÍTULO XXIII
Resorcina nos champôs e nas loções capilares
Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento da resorcina nos champôs e loções capilares por cromatografia em fase gasosa. Aplica-se a concentrações de 0,1% a 2,0% (m/m) do produto.

2 - Definição:
O teor em resorcina determinado por este método é expresso em percentagem da massa de resorcinol.

3 - Princípio:
A resorcina e o 3,5-di-hidroxitolueno, utilizado como padrão interno, são isolados da amostra por cromatografia em camada fina. Isolam-se os dois compostos destacando o suporte e extraindo com metanol. Os resíduos são em seguida secos, sinalizados e doseados por cromatografia em fase gasosa.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica:
4.1 - Ácido clorídrico a 25% (m/m).
4.2 - Metanol.
4.3 - Etanol a 96% (v/v).
4.4 - Placas de sílica em suporte plástico ou de alumínio, com indicador fluorescente, pré-preparadas e desactivadas.

Proceder da forma seguinte: vaporizar com água as placas de sílica até que se tornem brilhantes. Secá-las à temperatura ambiente durante uma a três horas.

Nota. - Se as placas não forem desactivadas, pode haver perdas de resorcina por adsorção irreversível sobre a sílica.

4.5 - Eluente: acetona, clorofórmio e ácido acético (20:75:5, em volume).
4.6 - Solução padrão de resorcina: dissolver 400 mg de resorcina em 100 ml de etanol a 96% (1 ml corresponde a 4000 (mi)g de resorcina).

4.7 - Solução padrão interno: dissolver 400 mg de 3,5-di-hidroxitolueno (DHT) em 100 ml de etanol a 96% (1 ml corresponde a 4000 (mi)g de DHT).

4.8 - Mistura padrão: misturar 10 ml de solução do n.º 4.6 e 10 ml de solução do n.º 4.7 num balão aferido de 100 ml, completar o volume com etanol a 96% e misturar (1 ml corresponde a 400 (mi)g de resorcina e 400 (mi)g de DHT).

4.9 - Reagentes de sinalização:
4.9.1 - N-O-bis-(trimetilsilil) trifluoracetamida (BSTFA).
4.9.2 - Hexametildisilazano (HMDS).
4.9.3 - Trimetilclorosilano (TMCS).
5 - Aparelhagem:
5.1 - Equipamento corrente de cromatografia em camada fina e em fase gasosa.
5.2 - Material de vidro de laboratório.
6 - Técnica:
6.1 - Preparação da amostra:
6.1.1 - Pesar com precisão, num copo de 150 ml, uma tomada de ensaio do produto (m gramas) contendo cerca de 20 mg a 50 mg de resorcina.

6.1.2 - Acidificar com ácido clorídrico (4.1) (cerca de 2 ml a 4 ml). Juntar 10 ml (40 mg de DHT) de padrão interno (4.7) e misturar. Transferir para um balão aferido de 100 ml com a ajuda de etanol. Completar o volume com etanol (4.3) e misturar.

6.1.3 - Aplicar 250 (mi)l da solução do n.º 6.1.2 numa placa de sílica desactivada (4.4), sobre uma linha contínua com cerca de 8 cm de comprimento. Tomar cuidado para obter uma banda tão estreita quanto possível.

6.1.4 - Colocar, separadamente e da mesma maneira (6.1.3), na mesma placa, 250 (mi)l de mistura padrão (4.8).

6.1.5 - Sobre a linha de partida, aplicar duas gotas de 5 (mi)l de cada solução dos n.os 4.6 e 4.7 para facilitar a localização após o desenvolvimento da placa.

6.1.6 - Numa tina não saturada, desenvolver a placa com o eluente (4.5) até que tenha percorrido 12 cm depois da linha de partida (quarenta e cinco minutos). Secar a placa ao ar e localizar a zona resorcina/DHT com luz UV de 254 nm. Os dois compostos têm aproximadamente o mesmo valor de Rf. Destacar as bandas assim marcadas e juntar o adsorvente de cada uma num matrás de 10 ml.

6.1.7 - Extrair o adsorvente que contém a amostra e o que contém a mistura padrão da seguinte maneira: juntar 2 ml de metanol (4.2) e extrair durante uma hora, agitando continuamente. Filtrar a mistura e repetir a extracção, durante quinze minutos, com 2 ml de metanol (4.2).

6.1.8 - Evaporar o solvente da totalidade dos extractos, colocando-os durante uma noite num exsicador, a pressão reduzida, com um exsicante adequado. Não evaporar com calor.

6.1.9 - Sinalizar os resíduos (6.1.8) como indicado no n.º 6.1.9.1 ou no n.º 6.1.9.2.

6.1.9.1 - Juntar 200 (mi)l de BSTFA (4.9.1) e deixar a mistura num recipiente fechado à temperatura ambiente durante doze horas.

6.1.9.2 - Juntar sucessivamente 200 (mi)l de HMDS (4.9.2) e 100 (mi)l de TMCS (4.9.3) e aquecer a mistura durante trinta minutos a 60ºC num recipiente fechado. Arrefecer.

6.2 - Cromatografia em fase gasosa:
6.2.1 - Condições operatórias:
A fase estacionária deve permitir um grau de resolução igual ou superior a 1,5:

R = 2 x (d'R(índice 2) - d'R(índice 1))/(W(índice 1) + W(índice 2))
em que:
R(índice 1) e R(índice 2) = tempo de retenção, expresso em minutos, de dois picos;

W(índice 1) e W(índice 2) = largura dos mesmos picos a meia altura;
d' = velocidade do papel em milímetros/minuto.
As condições operatórias seguintes permitem obter este resultado:
Coluna: aço inoxidável;
Comprimento: 200 cm;
Diâmetro: 3 mm;
Enchimento: 10% OV 17 em Chromosorb WAW 100-120 mesh;
Detector de ionização de chama;
Temperaturas:
Coluna: 185ºC (isotérmica);
Injector: 250ºC;
Detector: 250ºC;
Gás de arrastamento: azoto;
Débito: 45 ml/min.
Para a regulação do débito de hidrogénio e do ar seguir as instruções do fabricante.

6.2.2 - Injectar 1 (mi)l a 3 (mi)l das soluções obtidas no n.º 6.1.9. Fazer cinco injecções para cada solução. Medir a área dos picos de modo preciso e calcular a relação das áreas:

S = área do pico de resorcina/área do pico do DHT.
7 - Cálculo:
A concentração da amostra em resorcina expressa em percentagem (% m/m) é dada por:

Percentagem (m/m) de resorcina = 4/M x S amostra/S mistura padrão
em que:
M = tomada de ensaio, em gramas (6.1.1);
S amostra = razão média obtida para os picos da solução amostra;
S mistura padrão = razão média obtida para os picos da mistura padrão segundo o n.º 6.2.2.

8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para o teor em resorcina de 0,5% a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos realizados com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,025%.

CAPÍTULO XXIV
Sulfitos e hidrogenossulfitos inorgânicos
Identificação e doseamento
Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve a identificação e o doseamento dos sulfitos e dos hidrogenossulfitos inorgânicos nos produtos cosméticos. É aplicável somente aos produtos que contêm uma fase aquosa ou alcoólica e para teores até 0,2% expressos em SO(índice 2).

A - Identificação
1 - Princípio:
A amostra é aquecida com ácido clorídrico e o anidrido sulfuroso libertado é identificado pelo seu cheiro ou com o auxílio de um papel indicador.

2 - Reagentes:
2.1 - Ácido clorídrico (4 M).
2.2 - Papel indicador com iodato de potássio-amido, ou outro papel indicador.
3 - Aparelhagem:
3.1 - Material corrente de laboratório.
3.2 - Balão de 25 ml provido de um refrigerante de refluxo, curto.
4 - Técnica:
4.1 - Introduzir no balão (3.2) 2,5 g de amostra e 10 ml de ácido clorídrico (2.1).

4.2 - Misturar e aquecer até à ebulição.
4.3 - Detectar o anidrido sulfuroso pelo cheiro ou por meio do papel indicador (2.2).

B - Doseamento
1 - Definição:
O teor da amostra em sulfito, ou em hidrogenossulfito, determinado por este método é expresso em percentagem de massa de dióxido de enxofre.

2 - Princípio:
Após acidificação da amostra, o dióxido de enxofre libertado é destilado e recolhido numa solução de peróxido de hidrogénio. O ácido sulfúrico formado é doseado com auxílio de uma solução titulada de hidróxido de sódio.

3 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
3.1 - Peróxido de hidrogénio a 0,2% (m/v). Este reagente deve ser preparado diariamente.

3.2 - Ácido ortofosfórico (d(elevado 20)(índice 4) = 1,75).
3.3 - Metanol.
3.4 - Solução titulada de hidróxido de sódio: 0,01 M.
3.5 - Azoto.
3.6 - Indicador: mistura 1:1 (v/v) de vermelho de metilo (0,03% m/v em etanol) e de azul de metileno (0,05% m/v em etanol). Filtrar a solução.

4 - Aparelhagem:
4.1 - Material corrente de laboratório.
4.2 - Aparelho de destilação (v. esquema).
5 - Técnica:
5.1 - Pesar com precisão cerca de 2,5 g de amostra e introduzi-los no balão de destilação A (v. esquema).

5.2 - Juntar 60 ml de água a 50 ml de metanol (3.3) e misturar.
5.3 - Introduzir 10 ml de peróxido de hidrogénio (3.1), 60 ml de água e algumas gotas de indicador (3.6) no recipiente D, destinado a receber o destilado (v. esquema). Juntar algumas gotas de hidróxido de sódio (3.4), até que o indicador vire para verde.

5.4 - Proceder da mesma maneira no frasco lavador E (v. esquema).
5.5 - Ligar o aparelho e regular o débito de azoto (3.5) para cerca de 60 bolhas por minuto.

5.6 - Introduzir pelo funil 15 ml de ácido ortofosfórico (3.2) no frasco de destilação A.

5.7 - Aquecer rapidamente à ebulição e deixar ferver regularmente durante trinta minutos.

Aparelho para destilação do anidrido sulfuroso segundo Tanner
(ver documento original)
5.8 - Retirar o recipiente D que contém o destilado. Lavar o tubo e, seguidamente, titular por meio de uma solução de hidróxido de sódio (3.4), até que o indicador (3.6) vire para verde.

6 - Cálculo:
Calcular o teor em sulfito ou em hidrogenossulfito da amostra em percentagem de massa por meio da seguinte fórmula:

Percentagem (m/m) de dióxido de enxofre = 3,2 MV/m
em que:
M = concentração molar da solução de hidróxido de sódio (3.4);
V = volume (em mililitros) de hidróxido de sódio (3.4) necessário para a titulação (5.8);

m = massa (em gramas) da amostra (5.1).
7 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em dióxido de enxofre de 0,2% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,006%.

CAPÍTULO XXV
Sulfuretos alcalinos e alcalinoterrosos - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve o doseamento dos sulfuretos nos produtos cosméticos. A presença de tióis ou de outras substâncias redutoras (incluindo os sulfitos) não tem influência.

2 - Definição:
O teor da amostra em sulfureto determinado segundo este método é expresso em percentagem de massa (m/m) de enxofre.

3 - Princípio:
Após acidificação do meio, o sulfureto de hidrogénio formado é arrastado por uma corrente de azoto e seguidamente fixado sob a forma de sulfureto de cádmio. Este, após filtração e lavagem, é doseado por iodometria.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Ácido clorídrico concentrado (d(elevado 20)(índice 4) = 1,19).
4.2 - Solução titulada de tiossulfato de sódio 0,1 N.
4.3 - Soluções de iodo 0,1 N.
4.4 - Sulfureto dissódico.
4.5 - Di(acetato) de cádmio.
4.6 - Amónia concentrada (d(elevado 20)(índice 4) = 0,90).
4.7 - Solução amoniacal de di(acetato) de cádmio: dissolver 10 g de di(acetato) de cádmio (4.5) em cerca de 50 ml de água, juntar amónia (4.6) até à redissolução do precipitado (cerca de 20 ml) e completar a 100 ml com água.

4.8 - Azoto.
4.9 - Solução de amoníaco 1 M.
5 - Aparelhagem:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Balão de 100 ml com três tubuladuras esmeriladas normalizadas.
5.3 - Dois matrases de 150 ml, com rolha esmerilada, munidos de um dispositivo que comporta um tubo mergulhador e uma tubuladura lateral para a libertação do gás de arrastamento.

5.4 - Funil de tubo comprido.
6 - Técnica:
6.1 - Arrastamento dos sulfuretos:
6.1.1 - Escolher uma embalagem que não tenha sido aberta. Pesar com exactidão no balão (5.2) uma quantidade de produto correspondente, no máximo, a 30 mg de iões de sulfureto. Introduzir 60 ml de água e duas gotas de líquido antiespuma.

6.1.2 - Em cada um dos dois matrases (5.3), introduzir 50 ml da solução 4.7.
6.1.3 - Adaptar ao balão (5.2) uma ampola de decantação, o tubo mergulhador e o tubo de libertação de gases (5.3). Ligar, com a ajuda de um tubo de PVC, o tubo de libertação aos dois matrases colocados em série (5.3).

Nota. - Verificar a impermeabilidade da montagem do modo seguinte: nas condições do ensaio, substituir o produto a dosear por 10 ml de uma solução de sulfureto preparada a partir do n.º 4.4 contendo x mg de sulfureto (determinado por iodometria). Seja y o número de miligramas de sulfureto encontrado no fim do ensaio. O desvio entre estas duas quantidades, x e y, não deve ser superior a 3%.

6.1.4 - Fazer passar o azoto (4.8) a um débito de duas bolhas por segundo durante quinze minutos, para expulsar o ar contido no balão (5.2).

6.1.5 - Aquecer o balão a 85ºC (mais ou menos) 5ºC.
6.1.6 - Suspender a corrente de azoto e juntar, gota a gota, 40 ml de ácido clorídrico (4.1).

6.1.7 - Restabelecer a corrente de azoto (4.8) quando a quase totalidade do ácido se espalhou, deixando na ampola um mínimo de solução, para evitar as fugas de sulfureto de hidrogénio.

6.1.8 - Suspender o aquecimento passados trinta minutos e deixar arrefecer o balão (5.2), continuando a fazer passar a corrente de azoto (4.8) durante, pelo menos, uma hora e trinta minutos.

6.2 - Titulação:
6.2.1 - Filtrar o sulfureto de cádmio por filtro colocado num funil de tubo comprido (5.4).

6.2.2 - Lavar os matrases (5.3) em primeiro lugar com uma solução amoniacal 1 M (4.9) e deitá-la sobre o filtro; lavar seguidamente com água e utilizar esta água para lavar o precipitado retido sobre o filtro.

6.2.3 - Terminar a lavagem do precipitado com 100 ml de água.
6.2.4 - Colocar o filtro de papel no primeiro matrás que conteve o precipitado. Juntar 25 ml (n(índice 1)) da solução de iodo 0,1 N (4.3), cerca de 20 ml de ácido clorídrico (4.1) e 50 ml de água.

6.2.5 - Dosear o iodo em excesso com a solução titulada de tiossulfato de sódio 0,1 N (4.2). Seja n(índice 1) o número de mililitros utilizado.

7 - Cálculo:
O teor de sulfuretos da amostra expresso em percentagem de massa de enxofre (m/m) é calculado pela fórmula seguinte:

Percentagem (m/m) de enxofre = (n(índice 1) x x(índice 1) - n(índice 2)) x 32)/20 m

em que:
n(índice 1) = número de mililitros da solução titulada de iodo utilizado (4.3);

x(índice 1) = normalidade desta solução;
n(índice 2) = número de mililitros de solução titulada de tiossulfato de sódio (4.2).

x(índice 2) = normalidade desta solução;
m = massa da tomada de ensaio (6.1.1), expressa em gramas.
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em sulfuretos da ordem de 2% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,2%.

CAPÍTULO XXVI
Tosilcloramida sódica (cloramina T) - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
O método descreve o doseamento da tosilcloramida sódica total (cloramina T) nos produtos cosméticos por cromatografia em camada fina.

2 - Definição:
O teor da amostra em cloramina T estabelecido por este método é expresso em percentagem de massa (m/m).

3 - Princípio:
Em meio clorídrico a quente, a cloramina T hidrolisa-se totalmente em 4-tolueno-sulfonamida. A quantidade de 4-tolueno-sulfonamida formada é doseada por fotodensitometria após cromatografia em camada fina.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Tosilcloramida sódica (cloramina T).
4.2 - Solução padrão de 4-tolueno-sulfonamida: dissolver 50 mg de 4-tolueno-sulfonamida em 100 ml de etanol (4.5).

4.3 - Ácido clorídrico a 37% (m/m) (d(elevado 20)(índice 4) = 1,18).
4.4 - Éter.
4.5 - Etanol a 96% (v/v).
4.6 - Eluente:
4.6.1 - 1-butanol, etanol a 96% (4.5) e água (40:4:9, em volume).
4.6.2 - Clorofórmio e acetona (6:4, em volume).
4.7 - Placas para cromatografia em camada fina de silicagele 60 sem indicador de fluorescência.

4.8 - Permanganato de potássio.
4.9 - Ácido clorídrico a 15% (m/m).
4.10 - Reagente de pulverização: solução a 1% (m/v) de o-toluidina em etanol (4.5).

5 - Material:
5.1 - Material corrente de laboratório.
5.2 - Material corrente para cromatografia em camada fina.
5.3 - Fotodensitómetro.
6 - Técnica:
6.1 - Hidrólise:
Pesar com exactidão, num balão de 50 ml, cerca de 1 g(m) de amostra, juntar 5 ml de água e 5 ml de ácido clorídrico (4.3) e ferver durante uma hora sob refluxo. Transferir imediatamente a suspensão ainda quente, com água, para um balão aferido de 50 ml. Arrefecer e completar o volume com água. Centrifugar pelo menos cinco minutos a 3000 rpm e filtrar o produto sobrenadante.

6.2 - Extracção:
6.2.1 - Retirar 30 ml do filtrado e extrair três vezes com 15 ml de éter dietílico (4.4). Secar, se necessário, as fases etéreas e recolhê-las num balão aferido de 50 ml. Completar o volume com éter dietílico (4.4).

6.2.2 - Retirar 25 ml do extracto etéreo, evaporar à secura sob corrente de azoto. Retomar o extracto com 1 ml de etanol (4.5).

6.3 - Cromatografia em camada fina:
6.3.1 - Aplicar sobre uma placa de silicagele 60 (4.7) 20 (mi)l do resíduo dissolvido no etanol (6.2). Aplicar do mesmo modo 8 (mi)l, 12 (mi)l, 16 (mi)l e 20 (mi)l da solução padrão de 4-tolueno-sulfonamida (4.2).

6.3.2 - Desenvolver seguidamente até uma altura aproximada de 15 cm com eluente (4.6.1 ou 4.6.2).

6.3.3 - Após evaporação completa do eluente, colocar a placa durante dois a três minutos numa atmosfera de vapores de cloro, obtida do seguinte modo: juntam-se cerca de 100 ml de ácido clorídrico (4.9) a cerca de 2 g de permanganato de potássio (4.8) num recipiente fechado. Expulsar o excesso de cloro, aquecendo a placa a 100ºC durante cinco minutos. Pulverizar o reagente sobre a placa (4.10).

6.4 - Determinação:
Após cerca de uma hora, medir a intensidade da coloração das manchas violetas por fotodensitometria a 525 nm (5.3).

6.5 - Estabelecimento da curva de calibração:
A partir da altura dos picos obtidos, traçar a recta de aferição em função das quantidades (4 (mi)g, 6 (mi)g, 8 (mi)g e 10 (mi)g de 4-tolueno-sulfonamida).

7 - Nota. - O método pode ser controlado a partir de soluções a 0,1% ou 0,2% de cloramina T (4.1) tratadas nas mesmas condições que a amostra (6).

8 - Cálculo:
O teor de cloramina T na amostra expresso em percentagem de massa (m/m) é calculado pela fórmula seguinte:

Percentagem (m/m) de cloramina T = (1,33 x a)/60 x m
onde:
1,33 = factor de conversão de 4-tolueno-sulfonamida em cloramina T;
a((mi)g) = quantidade de 4-tolueno-sulfonamida expressa em microgramas na amostra e lida na recta de calibração;

m((mi)g) = massa da tomada de ensaio, expressa em gramas
9 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em cloramina T da ordem de 0,2% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados sobre a mesma amostra não deve ultrapassar 0,03%.

CAPÍTULO XXVII
Zinco - Doseamento
1 - Objectivo e campo de aplicação:
Este método descreve o doseamento do zinco presente nos produtos cosméticos sob a forma de cloreto, sulfato, fenolsulfato ou de combinações de vários sais em questão.

2 - Definição:
O teor em zinco da amostra, determinado por gravimetria de 2-metil-8-oxiquinoleato de zinco, é expresso em percentagem de massa (m/m) de zinco.

3 - Princípio:
O zinco em solução é precipitado, em meio ácido, sob a forma de 2-metil-8-oxiquinoleato. Após filtração e secagem, o precipitado é pesado.

4 - Reagentes:
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica.
4.1 - Amónia concentrada a 25% (m/m): (ver documento original).
4.2 - Ácido acético glacial.
4.3 - Acetato de amónio.
4.4 - 2-metil-8-oxiquinoleína.
4.5 - Solução de amónia a 6% (m/v). Deitar 240 g de amónia concentrada (4.1) num balão graduado de 1000 ml, completar com água destilada e misturar.

4.6 - Solução de acetato de amónio 0,2 M. Dissolver num balão aferido de 1000 ml 15,4 g de acetato de amónio (4.3) com água destilada. Completar com água destilada e misturar.

4.7 - Solução de 2-metil-8-oxiquinoleína. Num balão aferido de 100 ml dissolver 5 g de 2-metil-8-oxiquinoleína em 12 ml de ácido acético glacial. Perfazer até ao traço com água destilada e misturar.

5 - Aparelhagem:
5.1 - Balões aferidos de 100 ml e 1000 ml.
5.2 - Copos de vidro de 400 ml.
5.3 - Provetas graduadas de 50 ml e 150 ml.
5.4 - Pipetas graduadas de 10 ml.
5.5 - Cadinhos filtrantes em vidro G-4.
5.6 - Frascos para filtração sob vácuo de 500 ml.
5.7 - Trompa de água.
5.8 - Termómetro graduado de 0ºC a 100ºC, pelo menos.
5.9 - Exsicador contendo um exsicante apropriado com indicador higrométrico, por exemplo, gele de sílica ou equivalente.

5.10 - Estufa, regulada numa temperatura de 150ºC (mais ou menos) 2ºC.
5.11 - Potenciómetro.
5.12 - Placa de aquecimento.
5.13 - Papel de filtro Whatman n.º 4, ou equivalente.
6 - Técnica:
6.1 - Pesar 5 g a 10 g (M) da amostra a examinar, que devem conter 50 mg a 100 mg de zinco, e colocar num copo de 400 ml; juntar 50 ml de água destilada e misturar.

6.1.1 - Filtrar com o auxílio de uma bomba de vácuo, se necessário, e separar o filtrado.

6.1.2 - Repetir de novo a extracção com 50 ml de água destilada. Filtrar e misturar os filtrados.

6.2 - Acrescentar 2 ml de solução de 2-metil-8-oxiquinoleína (4.7) por dezena de miligrama de zinco contido na solução 6.1.2 e misturar.

6.3 - Diluir com 150 ml de água destilada, levar com 5.12 a temperatura da solução a 60ºC e acrescentar, agitando, 45 ml da solução de acetato de amónio 0,2 M (4.6).

6.4 - Agitando sempre, levar o pH da solução a 5,7-5,9 com solução de amoníaco (4.5); controlar o pH da solução por meio de um potenciómetro.

6.5 - Deixar repousar trinta minutos, aspirar a solução, por meio de uma trompa de água, através de um cadinho filtrante G-4, previamente seco (150ºC) e tarado após arrefecimento (M(índice o)). Lavar o precipitado recolhido no cadinho com um total de 150 ml de água destilada aquecida a 95ºC.

6.6 - Colocar o cadinho numa estufa regulada a 150ºC e secar durante uma hora.
6.7 - Retirar o cadinho da estufa, colocá-lo num exsicador (5.9) e determinar a sua massa (M(índice 1)) após ter voltado à temperatura ambiente.

7 - Cálculo:
Calcular o teor em zinco da amostra em percentagem de massa (m/m) por meio da fórmula:

Percentagem (m/m) de zinco = ((M(índice 1) - M(índice 0) x 17,12)/M
na qual:
M = massa, em gramas, da fracção da amostra examinada no n.º 6.1;
M(índice 0) = massa, em gramas, do cadinho filtrante vazio e seco (6.5);
M(índice 1) = massa, em gramas, do cadinho filtrante após precipitação (6.7).
8 - Repetibilidade (segundo a norma ISO 5725):
Para um teor em zinco da ordem de 1% (m/m), a diferença entre os resultados de dois doseamentos paralelos efectuados na mesma amostra não deve ultrapassar 0,1%.