Portaria 760/91
de 5 de Agosto
Considerando o Decreto-Lei 241/90, de 25 de Julho, que veio permitir aos laboratórios dependentes das direcções regionais de agricultura ou pertencentes a outras entidades para tal qualificadas a realização de diagnósticos e análises nas áreas de sanidade animal e da higiene pública veterinária;

Considerando a necessidade de estabelecer as metodologias de colheita, envio e análise de amostras, que devem ser respeitadas pelos laboratórios referidos:

Manda o Governo, pelo Ministro da Agricultura, Pescas e Alimentação, ao abrigo do artigo 4.º do Decreto-Lei 241/90, de 25 de Julho, o seguinte:

1.º A metodologia de colheita de material e respectivas normas da sua manutenção constam do anexo I a este diploma, do qual faz parte integrante.

2.º Os métodos analíticos a utilizar nas campanhas sanitárias promovidas pela Direcção-Geral da Pecuária no âmbito da brucelose, peripneumonia contagiosa dos bovinos, leucose bovina, peste equina africana e peste suína africana são os constantes dos anexos II a VI a este diploma, do qual fazem parte integrante.

Ministério da Agricultura, Pescas e Alimentação.
Assinada em 13 de Junho de 1991.
Pelo Ministro da Agricultura, Pescas e Alimentação, Álvaro dos Santos Amaro, Secretário de Estado da Agricultura.

ANEXO I
Colheita de material
1 - Colheita de sangue e conservação das amostras colhidas:
1.1 - O emprego de agulhas e seringas em numerosos actos veterinários de rotina é hoje uma prática banal. No entanto, o uso de material deste tipo não esterilizado e sua contaminação pela utilização sucessiva em animais de rebanhos diferentes ou em animais de um mesmo rebanho é a causa de numerosas doenças iatrogénicas víricas, bacterianas ou parasitárias.

A fim de evitar contaminações microbianas do sangue a enviar para análise, sempre prejudiciais à qualidade dos resultados das provas sorológicas, o acto da sua colheita deve ser efectuado com os indispensáveis cuidados de assepcia.

1.2 - A quantidade de sangue requerida para análise sorológica depende dos exames pretendidos e é, geralmente, de 3 ml.

1.3 - Para a pesquisa de anticorpos antivírus da peste equina africana é aconselhável colher 10 ml de sangue para frasco com a capacidade 20 ml a 30 ml.

1.4 - Após a colheita, poderá manter-se o sangue à temperatura ambiente (mas protegido do calor excessivo) até que se verifique a retracção do coágulo.

1.5 - Se necessário o coágulo pode ser descolado, rodando em volta com uma vareta, e a amostra colocada no frigorífico a 4ºC. Posteriormente, o soro poderá ser decantado ou removido por centrifugação.

1.6 - Se o soro não for analisado no prazo de 48 horas após a colheita, a sua conservação poderá fazer-se a -20ºC, em tubo hermeticamente fechado.

2 - Colheita de leite e conservação de amostras:
2.1 - A quantidade de leite a colher para a prova do anel (ring test) será no mínimo de 10 ml por cada tanque de refrigeração ou pote de recolha.

2.2 - Para cada amostra indicar-se-á o número de animais a que a mesma diz respeito.

2.3 - Se a amostra de leite não for enviada para o laboratório nas vinte e quatro horas seguintes à colheta, deve ser utilizado um dos seguintes conservantes:

a) Cloreto de mercúrio a 2% na proporção de 1 parte deste para 10 de leite;
b) Solução de formalina (7,5 ml de formalina comercial a 37% num litro de água destilada) na proporção de 1 ml desta solução por litro de leite.

ANEXO II
Brucelose
Bovinos
1 - Prova de aglutinação com o antigénio rosa-de-bengala (aglutinação rápida - AR):

1.1 - Esta técnica é preconizada como prova de rastreio inicial. O antigénio é constituído por uma suspensão de Brucella abortus, estirpe 99 (Weybridge), corada pelo rosa-de-bengala.

Na execução da prova será utilizado o soro positivo de referência nacional e um soro negativo.

1.2 - A prova é considerada positiva desde que se observe qualquer grau de actividade aglutinante.

2 - Prova de aglutinação em tubo (aglutinação lenta - AL):
2.1 - Todos os soros com actividade aglutinante na AR devem ser submetidos a esta prova, que, quando positiva, é considerada decisiva. Os soros que apresentam resultados duvidosos na AL devem ser sujeitos à prova de fixação do complemento.

2.2 - O antigénio utilizado nesta prova consiste numa suspensão de Brucella abortus, estirpe 99 (Weybridge), que se emprega na diluição de 1/10 em solução salina isotónica (0,85%) fenicada a 0,05%.

2.3 - O controlo da prova é feito pela utilização dos soros positivo de referência nacional, negativo e de um outro de título baixo.

2.4 - A prova é realizada em macrotécnica em tubo e os resultados expressos em unidades internacionais por mililitro de soro (U. I./ml), de acordo com as tabelas de conservação elaboradas e fornecidas pelo LNIV.

2.5 - Consideram-se negativos os soros que apresentem uma actividade aglutinante inferior a 30 U. I./ml, são duvidosos os soros com actividade aglutinante igual ou superior a 30 U. I./ml e inferior a 80 U. I./ml e são considerados positivos aqueles em que se verifique uma aglutinação igual ou superior a 80 U. I./ml.

2.6 - Os soros de bovinos vacinados com B19 só serão considerados positivos quando apresentem, até 12 meses após a vacinação, uma actividade aglutinante igual ou superior a 160 U. I./ml.

3 - Prova de fixação do complemento (FC):
3.1 - Esta prova é decisiva na confirmação dos casos duvidosos na AL e a ela serão sujeitos todos os soros com uma actividade aglutinante >=30 U. I./ml e <80 U. I./ml.

3.2 - A FC é realizada em microtécnica, após inactivação dos soros a 58ºC durante trinta minutos.

3.3 - O antigénio é constituído por uma suspensão de Brucella abortus, estirpe 99 (Weybridge).

3.4 - O antigénio, o complemento e o soro hemolítico (hemolisina) utilizam-se na dose de 2 U e os glóbulos vermelhos de carneiro numa suspensão de 3%.

3.5 - Na execução da prova faz-se o controlo do sistema hemolítico, do complemento (2,1 U e 0,5 U) e da acção anticomplementar do soro e do antigénio.

3.6 - A sensibilidade da prova é aferida com o soro positivo de referência nacional e a sua especificidade pelo emprego de um soro negativo.

3.7 - Na etiqueta da embalagem do antigénio fornecido pelo LNIV é indicado o factor de diluição a utilizar na prova.

3.8 - O resultado da prova de FC é expresso em unidades sensibilizadoras CEE (U. S. CEE) por mililitro. Consideram-se positivos os soros que apresentem 20 ou mais U. S. CEE/ml.

3.9 - Os soros dos animais vacinados com B19 serão considerados positivos quando apresentem, até 12 meses após a vacinação, um título igual ou superior a 30 U. S. CEE/ml.

4 - Prova do anel ou ring test, (RT):
4.1 - É uma prova expedita de rastreio e de controlo de rebanhos indemnes. Realiza-se em leite cru de mistura, devendo, em caso de positividade, proceder-se a provas sorológicas individuais.

4.2 - O antigénio é uma suspensão de Brucella abortus, estirpe 99 (Weybridge), corada com hematoxilina.

4.3 - A prova será efectuada após a refrigeração da amostra durante um período de quarenta e oito a setenta e duas horas a +4ºC.

4.4 - Na leitura dos resultados consideram-se negativas as amostras em que o leite se apresente corado e a nata descorada e positivas se houver coloração do leite e da nata ou somente da nata.

Pequenos ruminantes
1 - Prova de aglutinação com o antigénio rosa-de-bengala (aglutinação rápida - AR):

1.1 - Os resultados obtidos por esta prova são decisivos em rebanhos infectados.

1.2 - A prova é idêntica à utilizada para os bovinos.
2 - Prova de fixação do complemento (FC):
2.1 - É uma prova decisiva na confirmação do diagnóstico da brucelose.
2.2 - A prova é idêntica à utilizada para os bovinos, devendo, no entanto, os soros dos pequenos ruminantes ser inactivados a 62ºC durante trinta minutos.

ANEXO III
Peripneumonia contagiosa dos bovinos (PPCB)
1 - Prova de fixação do complemento (FC):
1.1 - A prova de FC para o diagnóstico da PPCB é realizada em microtécnica, após inactivação dos soros a 56ºC durante trinta minutos.

1.2 - O antigénio consiste numa suspensão de Mycoplasma Mycoides, subsp. mycoides, S. C., e é utilizado na dose de 2 U, o complemento emprega-se na dose de 2,5 U e a hemolisina ou soro hemolítico na dose de 12 U H 50%. A concentração de glóbulos vermelhos de carneiro é de 6%.

1.3 - Na execução da prova faz-se sempre o controlo do complemento (1 U e 2,5 U), do sistema hemolítico e da acção anticomplementar.

1.4 - A sensibilidade da prova é aferida com o soro positivo de referência nacional e sua especificidade pela utilização de um soro negativo.

1.5 - Na etiqueta da embalagem do antigénio fornecido pelo LNIV é indicado o factor de diluição a utilizar na prova.

1.6 - Consideram-se positivos os soros que apresentem 100% (+ + + +) de fixação do complemento da diluição de 1/10, duvidosos se apresentarem 50% ou 75% (+ + ou + + +) de fixação do complemento na mesma diluição e negativos quando a fixação do complemento for inferior a 50%.

ANEXO IV
Leucose bovina enzoótica (LBE)
1 - Prova de imunodifusão em gel de ágar (AGID):
1.1 - A AGID é uma dupla difusão num gel de ágar a 0,8%.
1.2 - O antigénio é preparado a partir do líquido sobrenadante de uma cultura de células FLK infectadas com vírus da LBE (VLBE). Este antigénio, que terá obrigatoriamente a glicoproteína 51 do VLBE, utiliza-se na concentração de 2 U.

1.3 - A prova inclui sempre um soro positivo de referência.
1.4 - A leitura dos resultados faz-se às vinte e quatro, quarenta e oito e setenta e duas horas. Considera-se positivo o soro que formar uma linha de precipitação específica com o antigénio e formar uma linha de identidade com o soro positivo de controlo.

ANEXO V
Peste equina africana (PEA)
1 - Prova de soro-neutralização:
1.1 - A prova é realizada em microtécnica em placa de fundo plano e feita em duplicado para cada soro.

1.2 - A inactivação dos soros é feita a 56ºC durante trinta minutos, procedendo-se do mesmo modo para com os soros positivos e negativos que servem de controlo da prova.

1.3 - Utiliza-se uma suspensão de células da linha VERO, com três a cinco dias de desenvolvimento, com uma concentração aproximadamente de 10(elevado a 6)/ml, que permitirá, dentro de dezoito a vinte e quatro horas, obter uma camada confluente na placa da prova.

1.4 - O título do vírus infectante da PEA utilizado é de 100-200 DICT50 por 25 (mi)l.

1.5 - A leitura dos resultados é feita pela interpretação do efeito citopático (ECP) às setenta e duas horas.

1.6 - Considera-se positivo o soro que repita um ECP entre 0% e 25% e negativo se o ECP for superior a 50%.

2 - Teste ELISA:
2.1 - Na execução desta prova usa-se um método de bloqueio. A dose de prova da gamaglobulina anti-VPEA equivale aproximadamente a 5 (mi)g de proteína.

2.2 - O antigénio é constituído pelo sobrenadante de uma cultura de células VERO após três dias de infecção com VPEA, concentrado com polietilenoglicol.

2.3 - O anticorpo é conjugado com biotina e como cromogénio é utilizado o OPD.
2.4 - É indispensável a utilização de soros de referência positivos e negativos como controlo.

2.5 - A leitura dos resultados é feita em espectrofotómetro e os resultados são expressos em percentagem de inibição da densidade óptica (DO) quando comparados com a média das DO dos soros positivos e negativos de controlo.

2.6 - Consideram-se negativos os soros que apresentem mais de 50% de inibição da DO e positivos até 50% de inibição.

ANEXO VI
Peste suína africana (PSA)
1 - Prova de imunofluorescência indirecta (IFI):
1.1 - Na prova de IFI usa-se como substrato do antigénio células da linha VERO infectadas com vírus de PSA (VPSA) em placas de microtitulação ou em lamelas em tubos de Leighton.

1.2 - A revelação da prova é feita com gamaglobulina anti-suíno conjugada com isocianato de fluoresceína.

1.3 - Os soros, antes de se colocarem em contacto com o substrato do antigénio, são inactivados a 56ºC durante trinta minutos e diluídos a 1/50 em solução fisiológica tamponada.

1.4 - São sempre feitos controlos com soros de referência positivo e negativo.
1.5 - A leitura da prova é feita em microscópio de fluorescência e são considerados positivos os soros que identifiqem as células infectadas com uma fluorescência específica do VPSA.

2 - Teste ELISA:
2.1 - É usado o método indirecto.
2.2 - O antigénio é constituído por uma preparação de proteínas purificadas do VPSA em que é dominante o polipeptídeo viral com o p. m. de 73.000 (VP73).

2.3 - O conjugado enzimático é proteína A e peroxidase e utiliza-se como cromogénio OPD.

2.4 - Como controlo da prova são usados soros de referência positivo e negativo.

2.5 - A leitura dos resultados é feita em espectrofotómetro e um soro é considerado positivo se o valor da DO for igual ou superior ao valor do controlo negativo mais 0,2.

2.6 - Os soros considerados positivos devem ser submetidos à prova de IFI para confirmação dos resultados.